肿瘤细胞内的程序性死亡配体1信号通路

绮罗林

细胞表面表达的程序性死亡配体1（PDL1）与免疫细胞程序性死亡受体1 （PD1）相互作用以逃逸抗肿瘤免疫的机制推动了阻断这些细胞外相互作用的抗体的开发。最近发现的癌细胞内PDL1信号拓展了对病理性肿瘤PDL1信号的理解，包括控制肿瘤生长、干性、免疫效应、DNA损伤反应和基因表达调控。而这些影响是独立于PD1的。

本文旨在介绍癌细胞内PDL1信号的研究历史和最新进展，信号控制机制和重要的免疫病理学影响，包括使癌细胞产生对细胞毒素、靶向小分子和免疫疗法的抗性。癌细胞内PDL1信号通路被认为是新的药物靶点，并且还有发展成能反映免疫治疗效果的生物标志物的潜力。本文也会对癌细胞内PD1信号、非癌细胞内PDL1信号以及可溶性和囊泡结合性PDL1和其亚型进行简单叙述。




介绍

程序性死亡配体1（PDL1；也被称为CD274和B7-H1）是一种免疫检查点分子，在1999年被科学家发现会在心脏、胎盘、肺和骨骼肌组织中表达并调节T细胞增殖和IL-10分泌。不久之后，研究人员发现癌细胞上也会表达PDL1，并且PDL1与T细胞上程序性死亡受体1（PD1）的相互作用会诱导T细胞凋亡以使癌细胞逃逸抗肿瘤免疫。阻断PDL1或PD1的抗体可提高小鼠癌症模型和人类的抗肿瘤免疫力并延长生存期。


包括这些抗体在内的免疫检查点阻断剂（ICB）以及阻断CTLA4免疫检查点的抗体现已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于癌症免疫疗法。抗PDL1或抗PD1抗体的主要抗癌机制被认为是阻止细胞表面PDL1对PD1+抗肿瘤T细胞的抑制作用，从而恢复机体的抗肿瘤免疫功能。尽管确实有一些癌症患者从ICB获得了较好的疗效，但ICB对大多数患者其实没有治疗效果，并且缺乏能够有效反应抗PDL1或抗PD1治疗效果的生物标志物，这说明存在替代或额外的PDL1相关的免疫病理和耐药机制。在癌症或非癌症细胞表面表达的PDL1会与免疫细胞表面的PD1相互作用，被激活的PD1下游信号不断传导最终逃逸抗肿瘤免疫。PDL1反向信号是指PD1与癌细胞表面PDL1结合并诱导癌细胞内PDL1信号通路的展开。


经典PD1-PDL1信号通路的定义是由肿瘤细胞表面PDL1诱导，免疫细胞PD1被其激活进而促使免疫细胞内部相应的信号传导（框1）。而癌细胞内PDL1信号通路，即由表面、细胞溶质或核PDL1诱导的细胞功能变化，可能是免疫致病性的，但与此相关的研究却很少。不过细胞内PDL1信号的转导也可能与PD1无关，而是源自特定亚细胞位置（例如细胞质和细胞核）的PDL1，这些PDL1通常借助翻译后修饰引导到特定细胞位置。除此以外，PDL1信号传导可源自分泌的、囊泡或外泌体PDL1或非基质细胞或血小板，而抗表面PDL1抗体也会影响肿瘤内PDL1信号。表1则重点关注癌细胞内PDL1信号如何控制癌细胞内和癌细胞之间的信号传递。




表1. PDL1信号通路机制及其产生的下游影响


癌细胞内PDL1效应于2008年被证明与其抗凋亡能力相关。2016年，有团队指出癌细胞内PDL1在小鼠和人类卵巢癌中发挥控制增殖、免疫非依赖性转移、雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号传导、自噬、小分子药物抗性和干性的作用。这之后相关的报告迅速跟进，指出来自癌细胞中各个亚细胞位置的内部PDL1会促进不同基因的表达和产生对细胞毒性化学疗法、放射线和其他治疗的抵抗力，包括抗PD1抵抗力，并抑制转录激活因子3（STAT3）和干扰素-β（IFNβ）的信号转导，特异性免疫细胞募集，IFNγ抗性和DNA损伤。胞质PDL1会促进一些参与DNA损伤响应的基因的表达。核PDL1会增加肿瘤细胞焦亡、抗PD1抗体的抗性、姐妹染色单体凝聚和基因组稳定性。但这些报告都没有详细说明这些变化是否存在PD1依赖性。已经有实验证明用小分子或抗体抑制癌细胞内PDL1信号转导并获得疗效的例子。

目前针对癌细胞内PDL1信号通路的治疗匮乏亦意味着崭新的药物开发机遇。而本文将详细讨论癌细胞内PDL1信号传导机制和主要影响，并提出新的治疗策略和对应生物标志物。最后，本文亦将讨论肿瘤细胞内PDL1信号的靶向问题。









PDL1结构与免疫细胞PD1的参与

PDL1是一种由290个氨基酸构成的1型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，结构类似于免疫球蛋白轻链（图1a），通过拮抗T细胞受体（反式和顺式）和CD28共刺激信号参与抑制抗肿瘤PD1+T细胞的功能。PDL1会和其他已知受体诸如免疫共信号分子CD80结合，以防止T细胞被共刺激激活。




图1. 癌细胞中程序性死亡配体的信号通路

PDL1蛋白有五个主要结构域（图1a）。这些结构域缺乏典型的信号基序，但细胞内在的PDL1信号同样可以被翻译后修饰进而改变其功能。例如，PDL1糖基化增强其蛋白质稳定性并与PD1相互作用，而PDL1被乙酰化会抑制其核易位，从而抑制抗PD1的功效。细胞内在PDL1信号可发生于细胞表面，细胞质或细胞核中发现的全长290个氨基酸肽段。表面表达的PDL仍然包含一个短的30个氨基酸的细胞质尾部，因此研究区分源自表面与完全胞质PDL1的细胞内在信号通路时必须要考虑这个细胞质尾部是否参与到了机制。


小鼠和人类PDL1具有高度结构和蛋白质序列相似性。抗PDL1可以增加CD80信号以激活抗肿瘤T细胞，但科学家对后者的作用仍然知之甚少。因为与PD1-PDL1相互作用相比，PDL1-CD80相互作用的研究要少得多。人类PDL1异构体1是通常被称为“PDL1”的全长蛋白质。当其完全在细胞内时，它的Ig-V和Ig-C结构域（PDL1在细胞表面时，两结构域是处于细胞外的）位于细胞内可以直接参与细胞内在PDL1的信号传导。图1a描述了至少五种PDL1异构体，均在人类细胞中但不在小鼠细胞中，其中一些具有信号功或诊断意义。大多数商业抗PDL1抗体识别与PD1结合的Ig-V结构域，从而阻断PDL1的Ig-V区域与PD1相互作用，但不识别缺乏Ig-V（PD1结合）结构域的PDL1亚型（亚型2）。现在存在另外一些能识别PDL1的C末端尾部的人类抗PDL1检测抗体（例如克隆405.9A11、E1L3N），其本身不干扰PD1接合，理论上可与PDL1亚型2结合，但尚未有关此方面的报导。抗PDL1或抗PD1抗体的主要抗癌机制被认为是防止PD1抗肿瘤T细胞受到癌细胞表面表达的PDL1的抑制，从而促进T细胞恢复活力、减少T细胞衰亡、增加T细胞记忆和肿瘤浸润免疫细胞的数量。

信号机制


尽管PDL1通常被认为是表面表达的，但它存在于许多亚细胞区室中（图1b）。细胞质PDL1可以以内吞体的形式循环到细胞表面。尽管细胞外源性与细胞内源性PDL1信号存在显着差异，但相同的PDL1分子可以根据亚细胞位置介导任一信号（框1；图1b）。PDL1在细胞表面的构象（包括其可溶形式或外泌体）类似于免疫球蛋白的三维结构。但在完全处于细胞内的PDL1中该构像会丢失（尽管线性Ig-V和Ig-C结构域可能基本保持不变），目前猜测这会影响PDL1与潜在的细胞内结合伙伴的相互作用。例如，PDL1-PD1的结合是通过在它们的免疫球蛋白样区域进行的，这些区域都存在复杂的三级构象，而细胞内PDL1却丢失了这些构像。因此，已知的PD1依赖性细胞内在PDL1效应可能只能通过表面表达的PDL1发生（图1b）。此外，翻译后修饰会将PDL1导向不同的亚细胞腔室，而在此类细胞器腔室中PDL1又会进一步发生变化最终影响PDL1信号传导，例如乙酰化，减少核PDL1数量以提高异位结肠癌模型中的抗PD1功效（图2）。


在癌细胞中观察到的细胞内在PDL1信号也在非癌细胞和非癌症、健康环境中检测到，包括自然杀伤细胞、T 细胞、脂肪细胞、动脉平滑肌细胞和树突状细胞，暗示PDL1是一种稳态分子。我们猜测非癌细胞中的PDL1信号相比于癌细胞时发挥者不同作用，正如癌细胞中的PDL1信号效应可能因肿瘤类型而异（框1；表1）。而框3中描述了额外的PDL1部分信号特征。



图2. 细胞内PDL1调节通路和潜在的靶点

1. 借助表面PDL1实现癌细胞内在信号传导
表面PDL1信号传导包括免疫细胞PD1或CD80的参与，但关于功能性CD80与PDL1结合的报导有限。尽管一些癌细胞表达CD80，但在癌细胞中尚未报导与PDL1顺式之间相互作用。在黑色素瘤中，癌细胞上的PD1可以与癌细胞表面PDL1相互作用，导致mTORC1 激活、细胞增殖和体内肿瘤生长71（图1b；表1）。虽然三阴性乳腺癌（TNBC）细胞也可以表达PD1和PDL1，但尚未有报道指出是该细胞的PD1和PDL1之间相互作用来引发其内在PDL1信号传导的。实际上这两者的相互作用受很多因素影响，比如PD1 N-糖基化水平会影响与PDL1的结合而PDL1的翻译后修饰会影响与PD1的结合。

治疗上，癌细胞的PD1-PDL1轴的内信号通路可以解释一些抗PDL1疗法治疗体外黑色素瘤和卵巢癌的机制。表面PDL1在与同在癌细胞表面表达的PD1相互作用，引发的细胞内信号转导会通过黑色素瘤中的磷酸化S6核醣体蛋白（p-S6）驱动细胞生长（图1b），不过该轴的活动需要在其他肿瘤类型中进行验证。而癌细胞内在PD1-PDL1信号轴在非小细胞肺癌细胞中反而通过拮抗p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-胞外信号调节激酶（ERK）信号通路来抑制癌细胞生长。当然以上这些结果需要进一步验证以排除来自不同研究对象遗传背景、肿瘤生物学或细胞特异性翻译后修饰差异化带来的偏差。目前尚未报导CD80会促进癌细胞内在PDL1信号转导。


不过癌细胞表面PDL1似乎在某些情况下通过非PD1受体（如体外各种人宫颈癌细胞上的β4整合素）诱导癌细胞特定的内在信号通路。在多种人膀胱癌细胞中，表面PDL1与表面β6整合素相互作用，通过FAK信号传导和对顺铂诱导的体外细胞凋亡的抗性来驱动癌细胞增殖。在霍奇金淋巴瘤的研究中发现，PD1在与PDL1作用后，借助PDL1细胞质尾部来实现反向信号传导，在体外驱动该细胞系和其他人类细胞系的凋亡抗性和细胞增长。抗PDL1抗体对肿瘤内在PDL1信号的影响稍后在“中断细胞内PDL1信号”一节中讨论。


2. 细胞内PDL1介导的信号传导
直接的蛋白质-蛋白质相互作用是引发癌细胞内PDL1信号的主要机制。PDL1与谷胱甘肽合酶激酶3β（GSK3β）、β-转导蛋白重复序列的蛋白（β-TRCP）、CKLF样MARVEL含跨膜结构域蛋白6（CMTM6）或CMTM4相互作用并通过蛋白酶体或溶酶体途径来调节细胞内总PDL1含量。而PDL1与组蛋白脱乙酰酶2（HDAC2）和亨廷顿蛋白1（HIP1R）的相互作用会通过内吞促进表面PDL1重新定位到细胞质、细胞核或溶酶体中。而当PDL1已处于细胞内时，通过与波形蛋白、p-STAT3（Y703）和核转运蛋白B1（KPNB1）的相互作用可以促进PDL1的核转位。一旦其入核，PDL1可以促进前肿瘤基因例如Gas6的转录（图1b；表1）。核PDL1可以通过与特定的DNA启动子区域结合改变基因表达，核PDL1很可能通过作为转录因子的辅助因子（例如特异性蛋白1）来发挥功能。细胞溶质PDL1被证明可以结合并稳定mRNA，从而增加MDA-MB-231细胞中含有GAAGAA/U 基序的特定DNA损伤修复蛋白的表达。核周或核PDL1与DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）相关，可在MDA-MD-231 TNBC细胞中激活MAPK或ERK以释放细胞存活信号。后两种机制似乎在体外引发了细胞毒性化学疗法的抗性，而与PD1或CD80无关。


不过，要确定这些竞争性细胞内PDL1信号传导是否介导了对DNA损伤剂的抗性还需要额外的机制研究，并评估这些发现的普遍性。鉴于DNA损伤可以诱导核PDL1积累并且PDL1也可以直接结合DNA，PDL1很可能以一种未知的方式参与了细胞DNA损伤应答通路。细胞内PDL1还可与大分子结构相互作用，包括与核内黏聚复合物结合并促进姐妹染色单体凝聚；与核内聚素亚基SA1相互作用以抑制基因组的不稳定和非整倍情况的出现。PDL1还可与溶酶体、自噬体和七种不同的寡聚高尔基体蛋白相关联，但这些相互作用的内在细胞表型效应仍不清楚。PDL1与自噬体的关联也意味着PDL1潜在的自噬控制效应。我们推测 PDL1所参与的相分离有助于为这种大分子相互作用效应提供基础。框3描述了细胞内PDL1的不同结构域在癌细胞内信号传导中的职责。


3. 来自未明确亚细胞位置的细胞内PDL1
癌细胞内PD1通过与PDL1作用以激活黑色素瘤细胞中的mTORC1，并促进癌细胞增殖。上文讨论了癌细胞内PDL1控制促生长mTORC1的信号传导，证明PDL1驱动的mTORC1激活和自噬抑制不一定相关，并且PDL1发挥的作用因肿瘤类型而异。PDL1介导的mTOR控制机制，包括对下游mTORC1靶目标相对影响和后果尚未有详细报导，还有待进一步研究。在某些肿瘤中，肿瘤干细胞的PDL1表达水平高于非干细胞。癌细胞内PDL1通过增加干性基因（例如Oct4和Nanog）的表达、自我更新和肿瘤生成来提高肿瘤干性。不过目前尚未有针对PDL1介导的干性调节机制的研究出现。




癌细胞内PDL1免疫效应

癌细胞内PDL1信号传导也可改变抗癌免疫。例如，细胞内PDL1可以抑制STAT3激活（图1b）以抑制小鼠黑色素瘤细胞对IFNα、IFNβ和IFNγ及其信号的敏感性，通过细胞焦亡促进肿瘤免疫原性细胞死亡，并在体外小鼠肥大细胞瘤模型中展现出对FAS-FASL介导的细胞凋亡的抑制。癌细胞内PDL1可在体外促进各种人TNBC细胞系中主要组织兼容性复合物 (MHC)1类的转录，理论上可以抑制自然杀伤细胞或提高抗原特异性免疫识别（表1）。癌细胞内PDL1还可借助自噬控制来调节抗原加工或呈递。尽管核PDL1可以上调MHC 1类表达从而增强抗肿瘤免疫反应，但它可以同时增加抑制性免疫检查点分子的转录（例如含有V型免疫球蛋白结构域的T细胞活化抑制因子(VISTA)、B7-H3和galectin-9）在体外的各种人TNBC细胞中可以抵消前者的影响并降低ICB功效。


这些发现表明细胞内PDL1对抗肿瘤免疫反应存在两种相反影响，其净效应可能在不同的肿瘤、环境或治疗中有所不同。例如核（去乙酰化）PDL1被证明通过尚未明确的机制介导抗PD1抗性，导致异位MC38结肠癌中活化的肿瘤浸润T细胞减少并且可能会增加4T1鼠 TNBC中的缺氧依赖性肿瘤相关炎症反应。癌细胞内PDL1信号还可调节人乳腺癌和结肠癌细胞中的DNA损伤反应，这可以抑制突变的积累和细胞质中受损核酸的感知，影响肿瘤免疫原性。亦可通过NOD-、LRR-和pyrin结构域的3（NLRP3）炎症小体募集免疫抑制细胞亚群来促进癌细胞抗PD1抗性。靶向细胞内PDL1信号可以进一步增强已知的选定药剂的免疫增强作用，不过这种策略并未得到验证。


以破坏细胞表面PDL1/PD1连接为目标的治疗性抗PDL1抗体也可以改变一些癌细胞内在的 PDL1信号。抗PDL1以被报导可在体外直接抑制黑色素瘤、卵巢癌细胞和膀胱癌细胞的增殖。抗PDL1抗体可以提高黑色素瘤对I型干扰素的敏感性并在体外激活STAT3介导的对小鼠黑色素瘤细胞中前肿瘤 NLRP3 炎性体的抑制作用。因为黑色素瘤PDL1促进NLRP3激活以增加体内抗PD1抗性，用抗PDL1抗体靶向细胞内在PDL1以逆转这种抗PD1抗性机制，不过此药效机制并未被实验证实。这种假说将抗PD1与抗PDL1结合应用成为可能。一项 RNA测序研究在体外测试了atezolizumab（人类抗PDL1）对人类MDA-MB-231 TNBC基因表达的影响，其结果表明它减少了上皮-间质转化和细胞生长。此结果表面抗PDL1抗体的细胞内作用尚未被完全挖掘。一种抗PDL1通过抑制PDL1与CMTM6的相互作用以增加溶酶体PDL1降解最终消耗总肿瘤细胞PDL1水平，该抗体在体外实验中增加了肿瘤细胞凋亡和对细胞毒性化学疗法的敏感性。抗PDL1抗体改变细胞内PDL1信号的作用可能是由于表面PDL1产生的非规范信号遭到破坏，亦或者可能是由于该抗体了干扰了表面PDL1向细胞质或细胞核的亚细胞重新分布。这些假说都需要实验进一步验证。


癌细胞内PDL1的代谢作用可以让肉瘤比T细胞更先竞争到葡萄糖，这可能会促进肉瘤细胞中的mTORC1活化，从而导致T细胞抗肿瘤能力降低。但免疫检查点抑制抗体用在一些癌细胞上会适得其反，比如抗PDL1（和抗PD1）在体外增强了人类非小细胞肺癌的增殖，此结果被认为可能是激活了AKT-ERK1/2信号引发的。除此以外，一些肿瘤类型和特定背景中抗 PDL1治疗也出现了失败。因此，以ICB为基础的抗PDL1和抗PD1功效机制需要被重新审视，更需要新的方法来靶向已对抗PDL1产生耐药性的癌细胞内PDL1信号。




细胞中PDL1水平调节

细胞内和亚细胞器中PDL1含量的调节具有自主性。总癌细胞PDL1含量取决于细胞周期，在人MDA-MB-231 TNBC细胞的G2/M期PDL1水平相对升高，而在人MDA-MB的G1期水平降低。核PDL1可能会在G2/M期积累，并且负责调节细胞中姐妹染色单体凝聚或染色体稳定。同样，临床观察到的PDL1 3'非翻译区被截断后会导致癌细胞总PDL1高表达，主要见于某些白血病、淋巴瘤和胃腺癌。目前亚细胞器结构中是否会出现PDL1表达这一现象还有待研究，但我们预测这种增强的PDL1表达水平会促进肿瘤进展。


细胞表面和胞质溶胶之间的PDL1分布受CMTM4/CMTM6/TRAPPC4和HIP1R的稳态调节，它们促进或抑制内吞体到表面PDL1的再循环（图2）。将Trappc4基因沉默会降低PDL1在小鼠结肠上皮细胞中的表达并在异位小鼠MC38结肠癌模型中提高体内抗PDL1功效并在体外提高T细胞对人RKO结肠癌细胞的细胞毒性。被沉默的基因通过促进PDL1在溶酶体的降解来减少肿瘤表面PDL1水平。除了CMTM6、TRAPPC4或HIP1R可以稳定调节表面PDL1含量，存在某些外源性细胞刺激源，如细胞毒性阿霉素或其他化学疗法可以促进表面PDL1重新分布到细胞质或细胞核，而这种效应的机制基础仍有待阐明。


随着研究的深入，科学家逐渐发现了功能性核PDL1的存在。一项描述PDL1乙酰化的研究表明，将人HCC1937 TNBC细胞与转化生长因子-β（TGFβ）共孵育会增加核PDL1的表达，其可能的原因为TGFβ促进了波形蛋白表达。波形蛋白可能会借助表面衍生PDL1乙酰化这一机制来促进核PDL1转位，但也有一种说法认为它会促进其他非表面亚细胞位置（例如细胞质）的PDL1的核质穿梭，此过程又与乙酰化无关。伴随着PDL1核定位和保留序列也被相继发现，其它PDL1入核机制也已得到严格证明。缺氧诱导的p-STAT3与人PDL1 C末尾部的结合会增加PDL1核定位能力。不过PDL1入核是否总是需要一个搭档还需要更多的实验验证。通过与KPNB1结合推动GAS6-酪氨酸-蛋白激酶 MER信号转导并最终促进肺癌中的PDL1核转位。但这种机制是否依赖于乙酰化或PDL1 C端尾部尚不清楚。我们推测除PDL1 C末端尾部以外的部分可能会增加PDL1核定位并介导其相关信号，不过这也要取决于特定的肿瘤类型和基因组视情况分析。核PDL1的生源目前仍然未知。核PDL1可能来自内质网或高尔基体中的翻译后修饰的PDL1、网格蛋白介导的表面内吞作用将其运输入核或直接来自合成的细胞溶质PDL1（图2）。


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