你没看错！8+非肿瘤生信+泛癌分析

溜溜达达

题目：Analysis and Experimental Validation of Rheumatoid Arthritis Innate Immunity Gene CYFIP2 and Pan-Cancer
发表期刊：Front Immunol                  IF=8.786


类风湿关节炎（RA）是一种慢性、异质性自身免疫性疾病。其高致残率对社会和个人造成严重影响，但目前仍缺乏有效可靠的RA诊断标志物和治疗靶点。在这项研究中，CYFIP2与各种肿瘤患者的预后、免疫细胞浸润程度以及TMB、MSI等指标密切相关，提示该基因可能是一种潜在的干预手段靶点是人类疾病，包括类风湿关节炎和肿瘤。
DEG筛选和数据预处理
数据在箱形图中标准化，其中不同的颜色代表不同的数据集，行代表样本，列代表样本中的基因表达值（图1A）。图1B描述了在显示批量删除之前多个数据集的PCA结果，其中不同的颜色代表不同的数据集。如图所示，三个数据集是分开的，没有任何交集。图1C显示了批量删除后的PCA结果图。如图所示，三个数据集的交集可以作为一批数据进行后续分析。在P-adjustment<0.05和log2fold-change(FC)的标准下，891个基因被鉴定为DEG(差异表达基因)，其中427个基因上调，464个基因下调。图1D显示了DEG的火山图以及前50个基因的热图（图1E）。



图1 DEG的数据预处理


DEG功能富集分析
根据p<0.05，所有DEG在功能上都得到了丰富，并且GOCircle图中显示了15个GO通路。研究结果表明，生物过程（BP）富集主要与细胞粘附调节、T细胞活化、淋巴细胞分化有关。丰富的分子功能(MF)与细胞因子受体结合、细胞因子结合和细胞因子受体活性有关。细胞成分(CC)富集与质膜、膜筏和膜微区的外侧有关。造血细胞谱系、人T细胞白血病病毒1感染、Th1和Th2细胞分化以及趋化因子信号通路在KEGG分析中相关联。
加权基因共表达网络构建
GSE1919和GSE55457数据集是从GEO数据中检索出来的，优选15个正常样本和18个RA样本对样本进行聚类，并通过设置阈值排除明显异常的样本，如图2A所示。然后，如图2B所示，当R2>0.9且平均连通性较高时，将软阈值设置为7。在使用0.25聚类高度限制（图2C）合并强关联模块后，确定了24个模块以供进一步研究。已启动和合并的模块最终显示在聚类树下（图2D）。接下来检查模块之间的相关性，结果显示它们之间没有显着关联（图2E）。模块描述的可靠性通过模块内的转录相关性分析得到证明，这表明模块之间没有实质性联系（图2F）。ME值与临床特征之间的正面相关性用于研究模块与临床症状之间的联系。蓝色模块与正常正相关，与RA负相关，而蓝绿色模块与正常负相关并与RA正相关(图2G)。确定了具有临床意义的模块。结果表明，在对照MM与GS散点图（图2H）和RAMM与GS散点图（图2I）中，蓝色和蓝绿色模块与RA高度相关。



图2 WGCNA共表达网络的构建


DEG和关键模块基因的功能分析
在使用维恩图重叠关键模块基因和DEG基因后，作者发现了490个重叠基因（图3A）。作者进行了功能分析，以了解更多关于模块中DEG基因的生物学功能的信息。DO分析结果显示，这些DEG与淋巴细胞白血病、肝炎、生殖细胞癌和造血系统疾病有关（图3B）。GO富集分析显示，模块DEG基因具有T细胞活化、细胞粘附调节、细胞活化正调节、质膜外侧、膜筏、膜微区、细胞因子受体结合、抗原结合、免疫受体活性（图3C）。KEGG分析与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和人类免疫缺陷病毒1型感染相关（图3D）。



图3 与DEG融合的关键模块基因的功能分析


特征基因的选择
作者使用三种机器算法来识别特征基因：SVM-RFE（图4A、B）、LASSO回归分析从统计显着的单因素中选择19个预测基因（图4C）、RandomForest结合特征选择来确定错误率、分类树数（图4D、E）和31个具有相对重要性的基因之间的关系。作者使用维恩图找到了使用上述三种方法的交集重叠的四个基因（图4F）。



图4 特征基因选择


特定基因表达的验证
作者使用GSE1919和GSE55447数据证实了这四种基因在RA中的表达，发现BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS在RA中均显着升高。此外，验证数据集（GSE48780和GSE55235）表明BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS在RA中大量表达。还检查了基因相关性，如图5所示，BTN3A2、ST8SIA1、TYMS和CYFIP2呈正相关，表明四个基因具有显着的功能相似性。



图5 性状基因之间的相关性


使用GSEA分析特征基因
为了更好地了解特征基因在RA中的作用，作者使用GSEA根据特征基因的中值表达将RA组织分为两类。核苷酸代谢、原发性免疫缺陷、嘧啶代谢和视黄醇代谢在高BTN3A2亚组中显着富集，而醛固酮调节的钠重吸收、HIF-1信号通路、氮代谢和肾细胞癌在低BTN3A2亚组中显着富集。可卡因成瘾、甘油脂造血细胞谱系、用于生产的免疫网络和原发性免疫缺陷在高CYFIP2亚组中显着富集，而同种异体移植排斥、用于IgA产生的肠道免疫网络、烟酸和烟酰胺代谢以及原发性免疫缺陷在高CYFIP2亚组中显着富集低CYFIP2亚组。铁死亡、亚油酸代谢、氮造血细胞谱系、用于IgA产生的肠道免疫网络、原发性免疫缺陷、Th1和Th2细胞分化在高ST8SIA1亚组中显着富集，而铁死亡、亚油酸代谢、氮造血细胞谱系、肠道免疫网络用于IgA生产、原发性免疫缺陷、Th1和。高TYMS亚组高度富集免疫缺陷、Th1和Th2细胞分化，而低TYMS亚组显着富集ABC转运蛋白、昼夜节律、糖酵解/糖异生和近端小管碳酸氢盐回收。
性状基因相互作用分析
作者使用GeneMANIA数据库为特征基因创建了PPI网络（图6A）。为了进一步研究特征基因的功能，对20个基因进行了GO/KEGG分析。肌动蛋白聚合或解聚、Rac蛋白信号转导和Arp2/3复合物介导的肌动蛋白成核控制是该数据集中最丰富的生物过程。细胞前缘、片状亚基和丝状亚基是最丰富的细胞成分(CC)。此外，RhoGTPase结合、RasGTPase结合、小GTPase结合和RacGTPase结合与丰富的分子功能(MF)相关（图6B）。根据KEGG分析，主要富集途径是肌动蛋白细胞骨架的调节、致病性大肠杆菌感染和沙门氏菌感染（图6C）。



图6 特征基因的相互作用分析


RA诊断柱线图的建模和测试
作者使用Rms包（图7A）为特征基因（BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS）构建了RA诊断柱线图模型，并使用校准曲线评估了它们的预测能力。校准曲线显示真实和预测的RA风险之间的差异非常小，表明柱线图模型RA非常准确（图7B）。模型的正确性也可以使用ROC曲线分析来确认（图7C）。“柱线图”曲线高于决策曲线分析(DCA)中的灰线，“BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS”曲线暗示患者可以从柱线图模型中受益高危阈值为0到1。柱线图模型提供了比“BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS”曲线更大的临床益处（图7D）。验证集（GSE48780和GSE55235）中的验证也证实了这些发现（图7E、F）。为了进一步验证BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS的诊断价值，作者使用了ROC分析，发现BTN3A2(AUC:0.841)、CYFIP2(AUC:0.928)、ST8SIA1(AUC:0.889)和TYMS(AUC:0.844)具有相似的AUC值（图7G）。验证数据集（GSE48780和GSE55235）也证实了以下发现：TYMS（AUC：741）、BTN3A2（AUC：0.858）、CYFIP2（AUC：0.867）、ST8SIA1（AUC：0.744）（图7H）。这些发现暗示所有主要基因都与RA有关。



图7 RA诊断柱线图模型的构建和验证

使用ssGSEA免疫相关性分析在RA组和健康对照中的免疫浸润
使用ssGSEA进一步研究了RA患者和健康对照之间的免疫浸润关联。结果显示，剔除无统计学意义的肥大细胞和RA组免疫细胞浸润低于对照组，其余RA组免疫细胞浸润及免疫相关通路均高于对照组。对照组(图8A)。作者知道CYFIP2与aDC、CCR、CD8+T细胞、检查点、溶细胞活性、DC、炎症促进、MHCI类、中性粒细胞、T细胞共抑制、T细胞共刺激、Tfh、Th1细胞有关、Th2细胞、TIL和I型IFN反应显着正相关，使用“corrplot”包计算特征基因之间的相关性。BTN3A2与APC共刺激呈负相关。CD8+T细胞、溶细胞活性、iDC、炎症促进、Tfh、TIL和I型IFN反应均与ST8SIA1呈强正相关（图8B）。这些特征基因可能在RA进展过程中调节免疫过程。



图8 RA与免疫之间的相关性

胶原蛋白诱发的关节炎（CIA）小鼠滑膜组织中CYFIP2和ST8SIA1的表达增加
为了验证RA滑膜中CYFIP2和ST8SIA1的表达，作者用IHC处理小鼠滑膜，发现CYFIP2和ST8SIA1CIA小鼠在滑膜中高度表达（图9）。



图9 CYFIP2和ST8SIA1在CIA小鼠滑膜中的表达

泛癌CYFIP2表达
从InnateDB数据库中检索免疫基因，并将四个特征基因交叉产生两个重叠基因（CYFIP2、ST8SIA1）。在结合ssGSEA结果后，作者将CYFIP2基因带到了下一个分析水平。由于免疫反应不仅在RA中而且在癌症中都至关重要，因此作者使用重叠的免疫基因来查看这两种疾病之间是否存在任何联系。在TCGA数据中，CYFIP2在BRCA、CHOL、HNSC、PRAD、THCA中高表达，而在BLCA、BRCA、COAD、ESCA、GBM、KICH、KIRC、KIRP、LUAD、LUSC和PAAD中低表达（图10A)。作者还从GTEx数据库下载了正常组织数据，发现CYFIP2在BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、HNSC、OV、PAAD、PCPG、PRAD、READ、SKCM、TGCT、THCA和THYM中强烈表达，而它在BLCA、CESC、GBM、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC和LUAD中弱表达（图10B）。如数据所示，CYFIP2在细胞系中表达（图10C）。



图10 CYFIP2表达

CYFIP2在泛癌中的预后价值
作者研究了CYFIP2表达与泛癌患者预后之间的关系，包括总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)和无进展生存期(PFS)。在OS分析中，33个肿瘤的cox回归显示CYFIP2表达与六种癌症中的OS显着相关：KIRC、LGG、PAAD、SKCM和THYM作为保护因素，UCEC作为风险因素（图11A）。在PFS研究中，33种肿瘤的cox回归显示CYFIP2表达与6种恶性肿瘤的PFS显着相关，在BRCA、HNSC、KIRC、LGG和PAAD中具有保护因素，在UCEC中具有危险因素（图11B）。在DSS分析中，33种肿瘤的Cox回归显示CYFIP2表达与5种癌症中的DSS显着相关：BLCA、KIRC、LGG和PAAD是保护因素，而UCEC是风险因素（图11C）。



图11 CYFIP2与泛癌预后的相关性

免疫浸润分析
为了进一步了解CYFIP2在肿瘤免疫反应中的作用，作者使用TIMER数据库计算了CYFIP2表达与不同免疫细胞浸润水平之间的联系。根据发现，18个肿瘤中的T细胞CD8+、20个肿瘤中的T细胞CD4+、23个肿瘤中的中性粒细胞、19个肿瘤中的髓样树突状细胞、12个肿瘤中的髓样树突细胞和23个恶性肿瘤中的B细胞。强连接。HNSC、LUSC、PAAD、SKCM、STAD、THCA和THYM显示出显着的正相关，而KICH和LGG显示出显着的负相关（图12A）。CYFIP2水平与入侵免疫细胞之间的联系也使用xCELL算法（图12B）、QUANTISEQ算法（图12C）、MCPCOUNTER算法（图12D）和EPIC算法（图12E）来证明。使用ESTIMATE算法计算基质评分和免疫评分的估计评分，结果显示免疫评分与13种癌症相关，而基质评分与16种肿瘤相关。其中免疫学评分与HNSC、LGG和STAD相关性最为密切。HNSC、LGG和UVM与基质评分的相关性最强。CYFIP2水平和免疫检查点在一系列癌症中显示出高度相关性，在UVM中大多呈正相关，在BLCA、BRCA、COAD、HNSC和PRAD中大多呈负相关，而这些在UVM中大多呈负相关。



图12 CYFIP2在肿瘤免疫反应中的作用

MSI和TMB分析
在TMB研究中，发现CYFIP2与BRCA、COAD、KIRC、LGG、LIHC、LUAD、PAAD、SARC、STAD、THYM、UCEC和UVM呈负相关。在MSI分析中，CYFIP2与COAD、DLBC、KICH、SARC和STAD呈正相关和负相关。
总结
为了探索免疫浸润与RA以及泛癌之间关联的特定核心基因，进行了全面而深入的分析，以分析相关基因和途径。发现的2个核心基因（CYFIP2和ST8SIA1）将拓宽对分子机制的认识，并为临床治疗带来更多潜在的治疗靶点，这也需要更多的研究来验证和开发。对于进一步的泛癌分析，CYFIP2被认为是RA和33种肿瘤中最具潜力的靶点，这可能为人类免疫相关疾病甚至癌症的治疗带来希望。

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