良心推荐：看懂这个7+m6A表观遗传调控肿瘤发生的生信 ...

永沐春光

题目：YTHDF1 promotes breast cancer progression by facilitating FOXM1 translation in an m6A-dependent manner
发表期刊：Cell Biosci IF=7.133


这项研究揭示了一种新的YTHDF1/FOXM1调节通路，它有助于乳腺癌的转移和进展，表明YTHDF1可能被用作潜在的生物标志物和治疗靶点。这也促进了对m6A表观遗传调控的乳腺癌肿瘤发生的理解。
YTHDF1在乳腺癌样本和细胞中高度表达
为了确定与可能驱动乳腺癌肿瘤发生的m6A修饰相关的蛋白质，作者首先探索了TCGA-BRCA数据集中m6A“readers”蛋白的表达。结果显示，乳腺癌样本中YTHDF1的表达明显高于正常对照组，但不同分期和亚型的乳腺癌患者中YTHDF1的表达无显着差异（图1A）。在收集的乳腺癌组织和通过RT-qPCR、蛋白质印迹分析和免疫组织化学染色验证的邻近正常组织中获得了类似的结果（图1B、G、H）。作者进一步探索了YTHDF1在细胞系中的表达,GSE71862数据集的结果显示，YTHDF1在乳腺癌细胞系MCF-7中的表达是人正常乳腺细胞系MCF-10A的1.6倍（图1C）。细胞系中的RT-qPCR和蛋白质印迹分析也表明YTHDF1的mRNA和蛋白质表达在乳腺癌细胞系中显着增加（图1D，I）。作者还观察了YTHDF1对乳腺癌患者预后的影响。TCGA-BRCA和GSE29272数据集的Kaplan-Meier分析表明，YTHDF1增加与OS缩短相关，OS是乳腺癌预后不良的标志（图1E，F）。此外，通过对TCGA-BRCA数据进行分层，作者还发现增加的YTHDF1可以进一步区分HER2+ 和Luminal亚型患者的预后。其高表达与预后不良显着相关。为了验证YTHDF1对乳腺癌的临床意义，作者在一组患者中收集并检查了它的表达以及临床病理学特征。结果表明，YTHDF1的高表达水平与乳腺癌患者的肿瘤大小、淋巴结浸润和远处转移呈正相关。总之，这些结果表明YTHDF1在乳腺癌中失调，并且YTHDF1的高表达与乳腺癌患者的不良预后相关。



图1 YTHDF1在乳腺癌样本和细胞中高表达


YTHDF1敲低抑制了乳腺癌细胞的生长能力并阻止了细胞周期
作者将靶向YTHDF1的shRNA转导到乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中以抑制YTHDF1的表达。转导48小时后，作者检测了YTHDF1的mRNA表达以验证敲低效率，结果显示所有三种shRNA均显着抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞中YTHDF1的表达（图2A）。然后作者使用scrambleshRNA转导的MDA-MB-231和MCF-7细胞（sh-NC）和sh-YTHDF1转导的癌细胞进行CCK-8和EdU细胞增殖测定。CCK-8结果表明，与sh-NC组细胞相比，sh-YTHDF1组细胞在孵育48h后的增殖受到显着抑制（图2B，C）。EdU细胞增殖试验还显示，与EdU培养基一起孵育2h后，sh-YTHDF1组乳腺癌细胞的增殖显着低于sh-NC组（图2D）。此外，作者还研究了YTHDF1对细胞周期的影响，结果表明sh-YTHDF1组发生了G0/G1细胞周期停滞。（图2E）。



图2 YTHDF1敲低抑制了乳腺癌细胞的生长能力并阻止了细胞周期


YTHDF1的沉默抑制细胞迁移、侵袭能力和EMT
然后作者研究了YTHDF1对乳腺癌细胞侵袭能力的作用。Transwell试验和伤口愈合试验表明，敲低YTHDF1可以有效抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移和侵袭能力（图3A、B）。据报道，上皮间质转化(EMT)是转移的第一步，在乳腺癌进展中发挥了重要作用。多项研究报道YTHDF1参与了EMT的分子调控途径。因此，采用免疫印迹法检测EMT相关蛋白，结果显示，与对照组相比，sh-YTHDF1组间充质蛋白N-cadherin、Vimentin、ZEB1和Snail的表达明显降低。相反，上皮标记蛋白E-钙粘蛋白被上调（图3C）。为了保证实验的准确性，使用si-YTHDF1转染的MCF-7细胞进行了类似的实验，结果表明，用siYTHDF1敲除YTHDF1后，MCF-7细胞的增殖和侵袭能力显着降低，EMT也受到抑制。



图3 YTHDF1的沉默抑制细胞迁移、侵袭能力和EMT


YTHDF1的消耗抑制体内乳腺癌细胞的生长
为了进一步研究YTHDF1在体内对乳腺癌的影响，将用含有阴性对照序列或sh-YTHDF1#2序列的慢病毒载体稳定转导的MCF-7细胞皮下植入NOD/SCID小鼠体内。通过每7天计算一次肿瘤体积，作者发现自第28天以来，sh-YTHDF1#2组的肿瘤体积明显低于sh-NC对照组（图4A）。第49天处死小鼠测量肿瘤重量，发现sh-YTHDF1#2组小鼠的肿瘤重量明显低于sh-NC组（图4B，C）。来自异种移植物的肿瘤细胞的蛋白质印迹分析和细胞周期测定表明，YTHDF1沉默可以抑制体内EMT并诱导乳腺癌细胞的G0/G1期细胞周期停滞（图4D，E）。此外，在肺转移试验中，sh-YTHDF1#2组的转移性肺结节数量显着少于sh-NC组（图4F）。总之，上述结果表明YTHDF1在体外和体内均能促进乳腺细胞的增殖和侵袭能力。同时，敲低YTHDF1可显着抑制乳腺癌的EMT。



图4 YTHDF1的消耗抑制体内乳腺癌细胞的生长

FOXM1是YTHDF1的直接目标
据报道，YTHDF1通过m6A修饰影响靶基因的翻译过程。因此，作者使用cBioPortal工具在TCGA-BRCA数据集中查找其蛋白质表达与YTHDF1mRNA表达相关的基因。最后，作者选择了12个基因作为进一步研究的目标（8个具有最高Spearman相关系数的基因（CCNB1、ENY2、SRC、FOXM1、CCNE1、CCNE2、ASNS和EIF4BP1）和4个先前报道受YTHDF1调节的基因(FZD5,FZD7,FZD9和WNT5A),m6A-IP和CLIP检测MCF-7细胞后,RT-qPCR用于检测目标基因的表达水平，作者发现FOXM1和CCNB1被占据YTHDF1和m6A同时修饰（图5A-C）。由于FOXM1在EMT中起着至关重要的作用，作者选择了FOXM1。作者通过估计Pearson相关系数R验证了来自TCGA的乳腺癌患者中YTHDF1和FOXM1表达之间的相关性。结果表明YTHDF1与FOXM1表达呈正相关（图5D）。此外，作者发现FOXM1蛋白表达在人类蛋白质图谱中的乳腺癌组织中高表达数据库（图5E）。研究cYTHDF1与FOXM1在蛋白水平的相关性，对9个样本进行了免疫组化分析。通过线性回归生信分析发现，FOXM1蛋白水平与YTHDF1呈正相关，相关系数R2 = 0.68（图5G）。



图5 FOXM1是YTHDF1的直接目标

另外，为探索YTHDF1是否调节FOXM1表达以及从哪个方面调节其表达，对sh-NC或sh-YTHDF1#2转导的乳腺癌细胞进行RT-qPCR、蛋白质印迹和多核糖体分析。结果表明，对于FOXM1，sh-NC和sh-YTHDF1#2组之间的mRNA表达没有显着差异。然而，在sh-YTHDF1#2组中观察到蛋白质表达显着降低（图5F，H）。如图5I所示，YTHDF1的抑制略微降低了MCF-7细胞的翻译水平。然而，YTHDF1敲低对FOXM1翻译的抑制作用明显超过18SrRNA。作者进一步在用YTHDF1-WT和YTHDF1-MUT质粒转染的MCF-7细胞中进行了多核糖体分析。YTHDF1的翻译水平在YTHDF1-WT中增加，但在YTHDF1-MUTMCF-7细胞中没有增加，表明突变体YTHDF1不促进FOXM1翻译。这些结果表明，作为YTHDF1的靶标，FOXM1不受YTHDF1的调控，通过影响其转录但促进FOXM1在乳腺癌细胞中的翻译。
YTHDF1以m6A依赖性方式调节FOXM1的表达
由于YTHDF1可以特异性识别m6A修饰并负责其靶基因的结果，因此作者尝试探索YTHDF1是否以m6A依赖性方式促进FOXM1翻译。将YTH结构域的突变引入YTHDF1-WT质粒以构建YTHDF1-MUT质粒。如图6A，B所示，抗Flag抗体用于RIP测定，随后进行RT-qPCR和蛋白质印迹分析以检测FOXM1的表达。结果表明，在转染YTHDF1-MUT质粒的MD-MBA-231和MCF-7细胞中，FOXM1与YTHDF1的结合显着降低。然后作者将突变引入FOXM1-WT质粒的m6A基序以构建FOXM1-MUT质粒（图6C）。随后，将FOXM1-WT和FOXM1-MUT质粒分别与空载体、YTHDF1-WT和YTHDF1-MUT质粒共转染到乳腺癌细胞中。结果表明，FOXM1的表达仅在用YTHDF1-WT和FOXM1-WT质粒共转染的细胞中显着增加，而FOXM1-MUT对YTHDF1-WT的过表达没有反应（图6D）。总之，这些结果证实YTHDF1以m6A依赖的方式调节FOXM1的翻译过程。



图6 YTHDF1以m6A依赖性方式调节FOXM1的表达


FOXM1过表达可以挽救YTHDF1沉默的抑制作用
作者进一步验证了YTHDF1/FOXM1轴在乳腺癌进展中的作用。将含有FOXM1序列(FOXM1)的质粒分别转染到sh-YTHDF#2MDA-MB-231和MCF-7细胞中。Western印迹分析用于验证转染效率（图7A）。随后，分别用sh-NC、sh-YTHDF1#2或sh-YTHDF1#2 + FOXM1对乳腺癌细胞进行CCK-8测定、transwell和伤口愈合测定。结果表明，YTHDF1的消耗抑制了肿瘤的增殖、迁移和侵袭，这被FOXM1的过表达部分消除（图7B-D）。与这些结果一致，蛋白质印迹分析证实sh-YTHDF1#2 + FOXM1细胞可以抵消YTHDF1沉默诱导的上皮和间充质标志物的变化（图7E）。



图7 YTHDF1沉默的抗肿瘤作用可被FOXM1过表达消除

为了进一步证实YTHDF1通过FOXM1调节细胞生长，作者将FOXM1-MUT质粒转染到sh-YTHDF1#2MCF-7细胞中，发现突变FOXM1不能逆转YTHDF1敲低诱导的细胞生长抑制（图8A-C）。结果证实FOXM1位于YTHDF1的下游。此外，设计了shRNA并将其转导到MCF-7细胞中以敲低FOXM1的表达（图8D）。通过CCK-8、Transwell侵袭和蛋白质印迹分析，作者发现FOXM1敲低显着抑制细胞生长、侵袭和EMT。此外，在FOXM1敲低的MCF-7细胞中，YTHDF1的过表达不能逆转由FOXM1敲低引起的对细胞生长的抑制作用（图8E-G）。总之，这些数据表明YTHDF1敲低阻断了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，但这可以同时通过FOXM1过表达来挽救。



图8 YTHDF1过表达不能逆转MCF-7细胞中FOXM1敲低引起的抗肿瘤作用

总结
作者研究了YTHDF1在乳腺癌中的特定生物学作用，作者的结果表明YTHDF1异常过表达并且与乳腺癌的不利存活率显着相关。此外，作者证明了YTHDF1通过YTHDF1/FOXM1轴在促进癌细胞增殖和侵袭方面发挥了至关重要的作用，从而加剧了乳腺癌的进展和转移。总的来说，作者的研究提出了一种新的YTHDF1调控途径，为乳腺癌治疗提供了新思路，并提示YTHDF1可能是乳腺癌患者的潜在生物标志物和治疗靶点。

拜天雨

向楼主学习