7+单基因肿瘤的生信思路，告诉你如何选对基因发高分文章！

潘武

今天给同学们分享一篇关于单基因肿瘤的生信文章“ Molecular Characteristics, Clinical Significance, and Cancer Immune Interactions of Angiogenesis-Associated Genes in Gastric Cancer ”，这篇文章于2022年2月发表在 Front Immunol 杂志上，影响因子=7.561。在这项研究中，EVA1B是一种蛋白质编码基因，是EVA1A基因的关键参数。本文通过研究探讨EVA1B在结直肠癌（CRC）进展和预后中的作用。



EVA1B在泛癌中的表达、遗传和表观遗传改变以及免疫学特征分析

图1描述了本研究的工作流程。与相应的正常组织相比，EVA1B（即FAM176B）在大多数癌症类型中的表达显着增加，包括BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LIHC、PRAD、READ、STAD和THCA（图 2A）。不同的是，在CESC、KICH、KIRP和UCEC中研究了下调的EVA1B。DNA甲基转移酶在改变染色质结构和基因表达中发挥关键作用。作者注意到EVA1B在大多数癌症类型中与四种主要的DNA甲基转移酶（包含DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B）呈现负相互作用（图 2B）。此外，EVA1B与各种癌症类型的DNA错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）呈负相关（图 2C）。M6A甲基化代表最常见的RNA修饰，它影响癌症进展的复杂性。作者专注于CRC中EVA1B与m6A调节剂的相互作用。根据EVA1B表达的平均值，将CRC患者分为高和低EVA1B表达亚群。如图2D所示，下调的EVA1B与大多数m6A调节剂相关，如CBLL1、VIRMA、METTL14和RBM15。TMB成为对免疫检查点阻止敏感的可靠生物标志物。在图2E中，EVA1B在THYM和LGG中与TBM呈现出非常积极的相互作用。相反，它与BRCA、CESC、ESCA、HNSC、STAD和UCEC的TMB呈负相关。作者注意到THCA、BLCA、DLBC、HNSC、KIRC 和PRAD中EVA1B与MSI的正相关，但在COAD、READ、STAD和UCEC中与MSI负相关（图 2F）。之后作者分析了EVA1B在泛癌中的免疫学特征。生信分析表明，EVA1B与泛癌的免疫细胞浸润（图2G）、MCH分子（图2H）、趋化因子（图2I）、免疫刺激因子（图2J）、受体（图2K）和免疫检查点分子（图2L）显著相关。




图1 本研究的工作流程



图2 泛癌中EVA1B的表达、遗传以及免疫学特征

EVA1B的预后意义及其与CRC药物敏感性的关系

作者还关注EVA1B在CRC中的生物学作用和意义。作者结合了TCGA项目的COAD和READ数据集，并删除了批处理效果（图 3A、B）。生存分析表明，高EVA1B表达的患者比低EVA1B表达的患者OS结果更差（图 3C）。靶向治疗在CRC管理中发挥关键作用，归因于CRC异质性的基因改变与对靶向治疗的反应相关。仍然非常缺乏用于靶向治疗的可靠预测生物标志物。因此，作者评估了EVA1B表达是否与药物敏感性相关。因此，EVA1B与对博来霉素、乐伐替尼、唑来膦酸盐、氟尿苷、米托蒽醌、辛伐他汀、拓扑替康和达沙替尼的敏感性呈正相关（图 3D）。不同的是，EVA1B表达与CRC中对尼罗替尼、他莫昔芬、帕比司他、多西他赛、长春瑞滨、克唑替尼、乙炔雌二醇和紫杉醇的敏感性呈负相关。因此，EVA1B可能是上述药物的预测标志物。



图3 EVA1B的预后及药物敏感性

EVA1B在CRC中的免疫学和生物学意义
作者的ssGSEA结果表明，在高EVA1B表达亚群中大多数免疫细胞的浸润水平显着增加（图 4A）。此外，高EVA1B表达与增加的基质和免疫评分以及降低的CRC中的肿瘤纯度相关（图 4B）。在高EVA1B表达亚群中，癌症免疫周期中大多数步骤的活性显着增强（图 4C）。作者还研究了高EVA1B表达亚群中免疫激活过程和基质激活过程的活性增加（图 4D）。此外，在CRC标本中评估了EVA1B表达与癌症免疫周期和已知生物学过程的相互作用。在图4E中，EVA1B表达与癌症免疫周期中的大多数步骤以及免疫和基质激活过程呈正相关。



图4 EVA1B在CRC中的免疫学和生物学意义

EVA1B与CRC突变的关系

在图5A中，作者评估了高和低EVA1B表达亚群中体细胞突变的患病率。APC、TP53和TTN位居前三个突变基因。然而，在高和低EVA1B表达亚群中没有研究体细胞突变的显着差异。GISTIC 2.0结果表明，与低EVA1B表达亚群（图 5D、E）相比，扩增和缺失在高EVA1B表达亚群（图 5B、C）中显示出更高的频率。此外，作者根据像差的幅度和它们在CRC标本中的发生频率计算了G分数。经过比较，突变发生在高EVA1B表达亚群的更多区域（图 5F，G）。



图5 EVA1B与CRC个体中的突变研究和信号通路的关联

与 EVA1B 相关的信号通路

作者进一步分析了通过GSEA涉及EVA1B的信号通路。在图 5H中，EVA1B的高表达与细胞粘附分子（CAM）、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、利什曼原虫相互作用、白细胞跨内皮迁移和VEGF信号通路呈正相关。同时，EVA1B低表达与细胞周期、同源重组、错配修复、核苷酸切除修复、卵母细胞减数分裂和剪接体呈负相关（图 5I）。以上数据表明EVA1B参与了多个致癌途径，说明了EVA1B的致癌作用。
EVA1B衍生基因的鉴定及其生物学意义

作者确定了CRC个体中的602个EVA1B衍生基因。进一步研究了它们的生物学意义。根据GO注释结果，EVA1B衍生基因主要与免疫反应相关。此外，EVA1B衍生基因与致瘤通路和免疫激活通路存在显着的相互作用（图 6A-B）。总体而言，EVA1B衍生基因可能在CRC进展中发挥显着作用。



图6 构建CRC预后基因组模型

用于CRC预后的EVA1B衍生基因组模型

使用单因素Cox回归模型，总共有66个EVA1B衍生基因与CRC患者的预后显着相关。通过随机生存森林分析，作者对上述预后EVA1B衍生基因的相对重要性进行了排名（图 6C）。作者确定了六个特征EVA1B衍生基因，包含IGFBP3、EGFL7、SULT1B1、MMP1、CYP2W1以及ISYNA1（图 6D）。在此基础上，进行多因素Cox回归分析，根据平均值将CRC患者分为高风险和低风险亚群（图 6E）。生存分析发现，低风险CRC个体表现出显着的生存优势（图 6F）。然而，在高风险和低风险亚群之间没有注意到生存状态的明显差异（图 6G）。此外，IGFBP3、EGFL7、SULT1B1、MMP1、CYP2W1以及ISYNA1的表达异质性显示在两个亚群中（图 6H）。ROC曲线证实EVA1B衍生的基因组模型在估计1年、3年和5年OS概率方面具有很好的效力（图 6I）。
验证EVA1B衍生的基因组模型在CRC中的预后意义
除OS外，作者的分析表明，与TCGA队列中的低风险亚群相比，高风险亚群表明DSS和PFS结局更不理想（图 7A、B）。EVA1B衍生的基因组模型的预后意义在外部队列中得到验证。作者的数据证实，高风险评分可预测GSE14333、GSE39582和GSE87211数据集中的不利OS结果（图 7C-E）。



图7 验证EVA1B衍生的基因组模型在CRC中的预后意义

EVA1B衍生的基因组模型预测CRC患者的药物反应

进行了进一步的分析以揭示这种EVA1B衍生的基因组模型是否可以预测CRC个体的药物反应。在图8A中，作者注意到高风险组与低风险组相比，舒尼替尼和多西他赛的估计IC50显着降低，表明高风险亚群对舒尼替尼和多西他赛的敏感性更高。同时，低风险组显示索拉非尼和吉西他滨的估计IC50显着降低，表明低风险亚群更有可能对索拉非尼和吉西他滨有反应。作者还评估了EVA1B衍生基因与药物反应的相互作用。结果，MMP1与光神霉素、放线菌素D、缩肽和高灵芝碱的IC50呈负相关；EGFL7与雷替曲塞、吉西他滨、阿糖胞苷和TFdU的IC50呈正相关；IGFBP3与lenvatinib和JNJ-42756493的IC50呈正相关，但与LEE-011、cobimetinib和selumetinib的IC50呈负相关；CYP2W1与替加氟和氟尿嘧啶的IC50呈正相关（图 8B）。这些数据表明EVA1B衍生的基因可能与对上述药物的敏感性有关。



图8 EVA1B衍生的基因组模型可预测CRC患者的药物反应

建立可靠的列线图预测CRC预后

单因素Cox回归分析揭示了年龄、分期、T、N、M和EVA1B衍生的风险评分与CRC预后的显着关联（图 9A）。其中，年龄、T和EVA1B衍生的风险评分作为CRC的独立预后指标（图 9B）。通过整合上述三个独立的预后指标，本研究利用列线图来估计CRC患者的生存结果（图 9C）。这个EVA1B衍生的风险评分对1年、3年和5年OS持续时间的预测贡献最大。ROC曲线证实了在预测患者生存结果方面的理想功效（图 9D）。此外，作者使用校准曲线评估了列线图的预测性能。作者的数据表明，该列线图预测的1年、3年和5年接近实际生存期（图 9E-G）。上述数据表明该列线图具有出色的预测能力。




图9 建立可靠的列线图用于预测CRC预后

涉及EVA1B衍生的基因组特征的分子机制

作者进一步研究了涉及EVA1B衍生的基因组特征的分子机制。如图10A所示，G2M检查点、mTORC1信号、MYC目标、DNA修复和氧化磷酸化等在低风险亚群中表现出更高的活性。同时，P53通路、TGF-β信号通路、细胞凋亡、Hedgehog信号通路、EMT、Notch信号通路和血管生成等高危亚群的致瘤通路显着激活，表明高危亚群的生存结果不佳。此外，免疫激活途径如同种异体移植排斥、炎症反应和补体在高危亚群中被显着激活。




图10 涉及EVA1B衍生基因组特征的分子机制以及EVA1B衍生基因的预后价值及其与m6A调节剂的相互作用和CRC中的免疫细胞浸润

EVA1B衍生基因的预后意义及其与m6A甲基化和免疫细胞浸润的相互作用。图10B表明TRADD、MXD4、NR1H2、EVA1B和C11orf68是CRC结果的风险因素。此外，作者研究了上述EVA1B衍生基因与m6A调节因子ALKBH5和RBM15B呈正相关，但与CRC中的其他m6A调节因子呈负相关（图 10C）。在图10D中，这些EVA1B衍生基因与激活的CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞、记忆B细胞和2型T辅助细胞呈负相关，但与CRC中的其他肿瘤浸润免疫细胞呈正相关。图10E显示了CRC个体的药物敏感性、预测性免疫反应和风险状态之间的关联。

EVA1B过度表达与CRC肿瘤发生和CRC患者预后不良相关
对来自19名肝转移CRC患者的对原发性CRC、相应的非癌性和匹配的肝转移标本进行EVA1B IHC。研究结果表明，与相应的非癌性正常组织相比，EVA1B在原发性CRC组织中过表达。此外，EVA1B在肝转移样本中的表达水平与匹配的原发性CRC组织中的表达水平相似，但没有统计学意义（图 11A、B）。生成KM生存曲线以探讨EVA1B在这131例CRC患者中的预后价值。研究结果表明，与EVA1B低表达水平的患者相比，EVA1B高表达水平的CRC患者的OS较差（图 11C）。 EVA1B表达的AUC值表明EVA1B准确地区分高表达组和低表达组（图 11D）。进行了单因素和多因素Cox回归分析，表明EVA1B通过调整分期、性别、位置、分化、分期、CEA和CA199作为预后因素是独立的（图 11E、F）。



图11 EVA1B过表达与CRC肿瘤发生和CRC患者的不良预后相关

总结
总体而言，作者的研究进行了生信分析，以揭示EVA1B在CRC中的分子特征、致癌作用以及相关的免疫和药物基因组学特征。作者的生信研究结果表明，EVA1B作为一个令人信服的预后标志物以及治疗反应的预测因子。

芊靖佰安

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