文献解读 | FFPE 样本磷酸化蛋白组学分析揭示肿瘤特异性 ...

绝伦千山

文章标题

临床样本收集和实验工作流程
乳腺癌组织样本来自Mayo Clinic，肺癌 FFPE 组织样本来自Moffitt Cancer Center。
*实验工作流程见图 1a
实验结果


为了定量表征少量 FFPE 组织的 pTyr 网络信号，研究人员开发了一种将基于 2,2,2-三氟乙醇 (TFE)的蛋白质提取和基于SP3 顺磁珠的样品处理相结合的前处理方法，该方法对 FFPE 组织的磷酸化蛋白质组学分析（图1a)，稳健且灵敏。使用该方案处理FFPE 组织的 10 μm 切片，其肽产量约为 2 μg/mm2，或者说 10 mm x10 mm x 10 μm 切片的肽产量约为 200 μg，也可以使用更大的 FFPE组织块切片进行缩放（Adj R2 = 0.95）。为了评估量化 FFPE 组织中 pTyr 信号传导的可行性，在LC-MS/MS分析之前，研究人员通过两步操作富集了含 pTyr 的肽，即使用抗 pTyr 抗体进行免疫沉淀 (IP) 和固定化金属亲和层析 (IMAC)去除非特异性保留的非磷酸化肽。研究人员对来自患者的异种移植 (PDX) 胶质母细胞肿瘤 (GBM6) 的 12 个 10 μm 切片富集的 pTyr 肽进行 MS 分析，在 4 个不同的 GBM6 中共鉴定出 1009、1031、1704 和 2165 个 pTyr 位点（图 1b），包括跨越多个激酶家族的 129 种激酶上的 pTyr 位点（图 1c）。pTyr 蛋白的基因本体分析发现了多种反应组通路的富集，包括轴突引导、Rho GTPase 信号传导、RTK 的信号传导、细胞周期和细胞衰老，进一步证明 pTyr 富集和分析可以深入了解肿瘤中激活的细胞通路（图 1d)。



图1 FFPE组织10 μm切片的酪氨酸磷酸化分析

为了评估该 FFPE pTyr 分析方案对少量样品的灵敏度和稳健性，研究人员分别从 1、2 或 3 个 10 μm厚的 FFPE 组织切片中提取了约 50、100 或 150 μg的肽，在 pTyr 富集和 LC-MS/MS 分析之前，用串联质量标签 (TMT) 标记 (图 1e)。对于 1、2 或 3 个切片，在重复样本中肽量化的中位变异系数 (CV) 分别为 13.5%、9.2% 和 6.7%，这表明使用单个 10 μm 切片也可以进行稳健的量化（图 1f）。与相同样品中平均单个切片的肽相比，1、2 或 3 个切片的中位倍数变化分别为 1.02、2.32 和 3.57（图 1g）。总之，这些数据表明对 FFPE 保存的组织标本的单个 10 μm 切片进行 pTyr 分析是可行的，并且可以产生数百个能广泛代表 GBM 肿瘤生物学的 pTyr 肽。


接下来，研究人员对来自肺癌组织库的 FFPE 临床样本进行了 pTyr 分析。研究共收集了 9 名 EGFR 突变的 NSCLC 患者的 FFPE 组织样本（图 2a），每位患者分别取两个 10 μm 切片，提取蛋白质并消化成肽。每份样本获得了 157-595 μg 的肽，表明对于大多数患者来说，单个 10 μm 切片足以进行 pTyr 分析。 pTyr 肽的 MS/MS 分析鉴定了 962 个位点，包括跨越多个激酶家族的 70 种激酶，如 Erbbs、粘着斑激酶和 MAPK。此外，研究人员发现基因组突变与EGFR磷酸化无关，例如，P4、P7 和 P9 都有 L858R 突变；然而，与 P4 相比，P7 和 P9 的 EGFR 磷酸化水平高出 2 倍和 10 倍（图 2b）。



图2  NSCLC 患者存档的FFPE 组织的酪氨酸磷酸化分析

为了识别每个肿瘤中激活的信号网络并提取共调节位点，研究人员对各个 pTyr 位点的共相关矩阵进行了层次聚类，形成3 个主要簇（图 2c）：簇 1 高度富集先天性和获得性免疫信号，包括 Fc epsilon RI 和 T 细胞受体信号通路（图 2d-e）; 簇 2 主要富集粘着斑和由 RHOA、ROCK2 和 ITGB1 等调节肌动蛋白细胞骨架通路的蛋白质组成; 簇 3 的磷酸化蛋白由几种核糖体蛋白和剪接因子组成。簇 1在P6、P8 和 P9中富集，表明在这些肿瘤中存在免疫浸润和激活，并且还有许多其他 RTK 的高磷酸化水平（图 2f）。有趣的是，簇 2 和 簇3 分别在患者 P1 和 P2 中高度富集，表明这些肿瘤可能部分是由剪接和核糖体失调以及整合素/粘着斑信号传导驱动的。总之，这些数据表明 EGFR 突变状态可能不能对 EGFR 磷酸化和激活做出良好预测。


研究人员对乳腺癌的FFPE和同时获得的冷冻组织临床标本进行了比较分析。20 个乳腺癌样本来自10 个肿瘤，其中 FFPE 组织块和匹配的快速冷冻肿瘤样本是从相同的肿瘤中平行采集的（图 3a）。每种组织类型进行蛋白质提取消化，TMT10plex标记和 pTyr 肽富集后进行分析。在 FFPE 和冷冻组织中分别鉴定和量化 了927 和 382 个位点，在两组分析中同时量化了 281 个位点。两组分析中含有 pTyr 位点的肽按患者聚类（图 3b），FFPE 和冷冻组织对之间的平均 Pearson 相关系数显著高于所有其他成对分析（图 3c），表明冷冻和 FFPE 组织之间的相似性超过了患者间的异质性。尽管它们相对相似，但热图和相关系数都表明配对的FFPE 和冷冻肿瘤并不相同。随后，研究人员提取了 FFPE 和冷冻样本之间相关性最高的位点。发现前 30 个最高度相关的位点属于 EGFR、MAPKs、STATs 和 PI3Ks 等蛋白质，其中许多是细胞信号通路中的重要节点，突出表明 FFPE 组织和冷冻组织在临床中能提供相似的失调生物网络信息（图 3d）。



图3 乳腺癌临床标本的磷酸化酪氨酸分析

接下来，研究人员评估了10个 FFPE 临床肿瘤标本中乳腺癌治疗潜在靶蛋白质的磷酸化状态，如ERBBs、MET、SRC、MAPKs 和 STATs 等，其中有 6 个标本被归类为雌激素受体 +/孕激素受体 + (ER+/PR+)，3 个被归类为三阴性（P1、P2 和 P5），1 个在功能上类似于 TNBC（P8）。为了量化磷酸化，研究人员对每个感兴趣的蛋白靶标的多个 pTyr 位点进行平均，并绘制相对于所有 10 个肿瘤的平均值（图 3e）。该分析发现了不同患者中蛋白质的差异激活，比如P1相对具有较高的EGFR磷酸化，P3具有相对较高的ERBB3磷酸化，而P8除了具有相对较高的PDGFRB，SRC和PISKR2磷酸化外，还具有相对较高的所有ERBB家族蛋白磷酸化水平，表明P8存在多种潜在驱动因素，或者可能是更加异质的肿瘤。MET在P2和P5中高度上调。这种蛋白质靶点的差异磷酸化突出了潜在的患者特异性致癌驱动激酶。随后研究还通过 T 细胞受体 (CD247) 的高磷酸化评估确定了 P5 和 P6 中的T 细胞免疫浸润和激活，表明免疫检查点抑制剂对这些患者可能有效。此外，在每个患者的冷冻肿瘤样本中还观察到了相同癌基因的高度磷酸化。这些结果表明，FFPE 组织可能提供与临床冷冻组织相似的生物学意义信息。


GBM6 PDX 肿瘤的分析展示了包括 RTK 在内的各种蛋白质的磷酸化（图 1）。因此，研究人员提取了属于 RTK 的 20 种最丰富的磷酸肽，以确定 GBM6 肿瘤是否由特定的 RTK 驱动。最丰富的3个以及前 20 个中的 11 个磷酸肽属于 EGFR（图 4a）。与 EGFR 激活呈正相关的充分表征位点被高度磷酸化，这表明 GBM6 肿瘤是由 EGFR 驱动的。接下来，研究人员用阿法替尼（一种第二代 EGFR 抑制剂）或载体（对照）治疗体内GBM6 PDX 肿瘤，以确定 1）PDX 对 EGFR 抑制的反应，2）该方法可否广泛用在临床来测量治疗反应，3）了解 FFPE 保存对受控环境中 pTyr 信号传导的影响。肿瘤切除后，一半在液氮中快速冷冻，另一半被处理成 FFPE 块（图 4b）。根据上述方案，1)FFPE 组织在 90°C， 50% TFE 中裂解并提取蛋白质、2) 快速冷冻组织在热 TFE 中裂解（以下称为 Frozen-TFE）和 3) 用标准 8M 尿素裂解 (Frozen-Urea) 快速冷冻组织并消化成肽，TMT标记， pTyr富集后进行 LC-MS/MS 分析。对 pTyr 信号的分析分别从 FFPE、Frozen-TFE 和 Frozen-Urea 中鉴定和定量了1128、1085 和 649 个肽段（图 4c）。结果表明， FFPE 保存可能导致样品之间的变异性增加，FFPE 和冷冻组织之间存在一些显著差异。pTyr 在蛋白质提取步骤中发生的变化很小，但在 FFPE 保存过程中变化更明显 。在Frozen-Urea和 FFPE 条件之间至少有 2 倍差异的位点属于EGFR、GAB1、SPRY4 和 MAPK1，表明这些位点可能对 FFPE 处理相关的变化敏感。与 pTyr 数据相比，pSer/Thr 数据和蛋白质表达数据仍按处理条件聚集，而不受保存或处理技术的影响。 尽管 CV 相似，但在载体与阿法替尼条件下存在显著差异的肽百分比在 FFPE 组织中仍然较低（图 4c）。 出乎意料的是，与Frozen-TFE 相比， FFPE 组织样品中的 pTyr 肽强度更高。
所有三个工作流程中量化的肽或蛋白质的主成分分析 (PCA)表明，尽管组织保存和处理方法不同，但 pTyr、pSer/Thr 和蛋白质水平根据阿法替尼治疗而分离（图 4d-f）。此外，在特定肽的基础上对不同保存和处理方法之间的相关性研究表明，在Frozen-Urea和 FFPE 组织之间，处理过的平均倍数变化与对照样品高度相关（图4g-i）。总之， FFPE 组织中的 pTyr 信号传导与冷冻组织相当，但并不完全相同，因为 pTyr 信号传导在福尔马林固定期间发生了一些变化。



图4 阿法替尼治疗后 FFPE 和速冻组织中 pTyr、pSer/Thr 和蛋白水平的比较


研究人员评估了与冷冻组织相比，FFPE组织是否仍然可以提供阿法替尼治疗效果的生物网络信息。经检测发现，与载体对照相比，阿法替尼治疗的肿瘤中EGFR 通路的几种蛋白质酪氨酸磷酸化降低了 2-10 倍，包括 EGFR 本身，以及在 GAB1、SHC4、PTPN11 和 MAPK3 (ERK1)等 上的位点（图 5a）。此外，其他位于 EGFR 下游的蛋白质，如 CBL（内吞作用）和 STAT5A/B（JAK-STAT 通路）等也在阿法替尼治疗的肿瘤中下调 pTyr 水平。尽管冷冻和 FFPE 组织中都可以观察到阿法替尼的治疗效果，但与 FFPE 相比，冷冻组织中 EGFR 通路的下调，在不同肿瘤中的倍数变化和可重复性方面更为突出。事实上，与冷冻对或载体对照相比，有两个阿法替尼治疗的FFPE肿瘤样本在 EGFR 和 GAB1 中甚至具有更高的 pTyr 水平。



图5 pTyr 和蛋白质水平对阿法替尼治疗的反应变化

尽管阿法替尼使 EGFR 通路中 pTyr 信号通路下调，但也使 EGFR 和 GAB1 在蛋白质水平上调（图 5a），突出了潜在的治疗耐药通路。此外，作为对阿法替尼的反应，肿瘤在含有盘状结构域的上皮受体 1 (DDR1)、酪氨酸激酶非受体蛋白 Src 和多种 Src 家族激酶底物中表现出更高的 pTyr 水平（图 5b），表明 Src 和 Src 家族激酶 (SFK) 作为 EGFR 抑制的抗性机制。响应阿法替尼而pTyr 水平增加的磷蛋白形成了与 RTK 信号传导和运动通路相关的强相互作用网络（图 5c）。这些适应性抗性通路可以从冷冻组织及其 FFPE 对应样本中读出，表明尽管在保存过程中发生了一些信号改变，但与冷冻组织相比，FFPE 组织的 pTyr 分析可以提供相似的生物学信息。总之， FFPE 组织的 pTyr 分析可用于激酶活化的判定和临床药物治疗响应的监测。


原文链接：https://aacrjournals.org/cancerres/article/81/14/3930/670240/Quantitative-Analysis-of-Tyrosine-Phosphorylation
编译：陈善军
审校：钱丽琴、江燕、周承

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