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Abstract
人类呼吸道是一个巨大且具有空间异质性的生态系统，由长达上百千米的气道和面积大于皮肤表面三十倍的表面组成。从微生物富集的咽部延伸到微生物稀疏的肺泡，存在着微生物移入与清除的动态平衡。因此，对肺部微生物取样需要特殊的考虑：解剖学、生理学、微生物学以及程序化。在这一章，讨论了肺部微生物取样的常使用技术，并回顾了常用方法背后的基本原理和证明，提供了关于咽部感染和测序感染这两个关键问题的建议。
Introduction
目前微生物领域研究较多的是下胃肠道样本微生物研究，取样较为容易：粪便样本较容易取得并且下胃肠道样本的微生物生物量大，已有研究提出“gut-lung axis”用于解释肠道微生物群对肺泡免疫的间接影响，最近的人类和动物实验观察表明肺部免疫同样与肺部微生物互作相关。因此，更深一步的理解微生物在肺部健康和疾病中扮演的角色需要对呼吸道微生物进行直接取样。
肺在解剖学、生理学、免疫学、最重要的是生态学上与肠道不同，因此有着独特的取样挑战，取样时需要考虑潜在的来自上呼吸道（URT）和普遍存在的环境DNA污染。在这章中，我们提供了肺部微生物取样的概念性框架，同时探测“signal in the static”：从低生物量微生物组研究中存在的污染和测序复杂性中，区分出有意义的细菌信号。同时提供了常用微生物样本的调查，讨论了与动物建模相关的特别考虑。
一.人类呼吸道的解剖学和细菌拓扑性
比较肺与更经常研究的胃肠道之间的解剖学和微生物学异同：
肺和肠道都是有腔的器官，被粘膜包附，具有同一胚胎起源。
肠道总框架相对简单（一个9米长的管道），而气道在人类肺中分裂至少23次，肺泡面积达70 m^{2} ，是皮肤面积的30倍，胃肠道面积的两倍。
胃肠道的微生物移动是没有方向的（从嘴巴到直肠），被各种的物理、化学障碍打断（如胃酸、十二指肠的碱性环境），与之相反，呼吸道中的空气和微生物的移动是双向的，在喉部和最末端的肺泡空间中没有物理障碍。
尽管肠道和大部分气道都排列着分泌的粘液，但是肺的绝大部分表面排列着脂类丰富的表面活性剂，有选择性抑制细菌的效果。
以上的解剖和生理学不同导致的生态学、微生物学结果深远，影响肺微生物的burden、stability、identity: 肺部微生物的密度很低，且稳定性低，在健康人群中易受环境影响，与下肠道微生物群相比流动性更强(more dynamic)，这些与解剖学的观察一致；
肺部微生物群体与口咽微生物群体类似，这种相似性具有物种特异性，不如在小鼠和马中那么强烈，这可以推测反映了我们做为直立灵长类独立的结构：在喉和分叉气道的上方有一个微生物储备区（咽）。
二.与取样相关的呼吸系统关键生态特征
URT与URT之间的是双向流动的：
LRT持续暴露在URT的低水平-包含细菌分泌物中（via 亚临床微小吸入），另一方向，LRT中的内容物通过粘液纤毛清除和咳凑持续被推动向上。因此，肺微生物与口咽微生物的相似性是由于两部分持续地、动态地交流。口咽感染并不影响二者的相似性。
三.肺部微生物取样的信号与静电干扰（signal vs. static）
取样位点的选择：不存在“金标准”,The sicence should drive the specimen selection,and not vice versa.取样策略需要与手上的生物学、微生物学和临床问题相适应。
肺部微生物样本处于两个极端之间：信号极强的土壤样本和信号极弱的血液等样本，LRT的微生物信号比肠道弱很多，易受两个因素影响：口咽感染和测序噪音。
口咽感染：
BAL和保护性样本刷样本中的咽部微生物影响较小，手术切除的肺部组织绕过了URT，减少了咽部感染。
测序噪音：
所有的低生物量测序研究在测序中受到两种严重的噪音来源：
1.试剂污染 reagent contamination ，试剂污染是超低生物量微生物组研究的主要type 1 error来源，且是可重复的错误。
2.低生物量测序的随机性stochasticity of low-biomass sequencing，对稀疏DNA群体取样会造成不稳定、不可靠的随机结果，这种随机性是不可重复的错误。
两种错误可区分的差别就在于是否可重复：试剂污染造成的错误测序信号在重复样本间具有相似性，而取样随机性造成的噪音在重复样本间并不相似。
其他测序噪音来源：样本Barcode标签的错误使用造成的taxa错误归类。
关键：discriminate the signals from the static.
做到这点，需要深思熟虑于样本选择、取样方法（包括了所有适当的流程和测序控制）、分析计划。
三.肺部微生物取样的常见方法
1.支气管镜取样
除了痰液，支气管镜取样样本是肺部微生物组研究中最常见的样本类型，能避免咽部感染，被认为是LRT取样的impefect reference standard。后续的取样样本（用保护性样本刷对气道壁取样和BAL）能够准确反映LRT微生物群的真实情况。
BAL：
内窥镜伸到segmental or subsegmental orifice ,气道中的“wedged”,徐徐滴入生理盐水，再抽吸出来并捕获。这样不光取样肺泡空间，而是包括了楔形位点下游的所有小气道的黏膜表面。BAL的限制是可变的稀疏程度：即使滴入的生理盐水量相同，返回的灌洗液差别很大，这个限制不会阻碍破解肺部微生物组数据，原因有1.相对丰度的数据是组成型（fractions of a whole）的而不是绝对的；2.样本间的细菌DNA载量变化远远大于灌洗液体积导致的相对变化。intra<<inter，一个样本无需多位点采样。
保护性样本刷：
安全的取样于气道黏膜，主流应用于研究慢性器官疾病如哮喘，取样面积小，细菌载量远小于BAL。
这两种方法均要在镜检、后续测序和质量上做严格的程序控制（p7~p8）
2.痰液
痰液是多种慢性气管疾病包括哮喘、囊肿性纤维化、支气管扩张的重要样本类型，是一种复杂、异质性的物质，在不同的疾病中的组成不同，可包含粘蛋白、DNA、肌动蛋白、其他生物聚合物、血液、粘液栓、宿主细胞和微生物细胞。
痰液样本代表的呼吸道哪个位置不能确定，当痰液咳出时可能带有唾液感染，但是患有严重疾病的患者不能做镜检，痰液是唯一一种能取样LRT的办法，与支气管镜取样相比的好处是能够频繁的取样，不需要患者处于镇静状态和麻醉，且取样不侵入人体。一些病人不能自发的产生痰液，在治疗中停止产生痰液，导致在设计干涉的纵向实验的取样中断。
由于痰液是粘稠的难用移液器吸取，因此经常加入二硫苏糖醇来稀释样本以便处理，这一步要小心，因为在样本中加入任何东西都会引起亚选择组织的存在，然而微生物组的研究需要考虑维持组织呈现在体内的丰度。在我们自己的工作中，在痰液中即可冷冻不添加任何试剂，处理成整分部分方便后续分析。
分析痰液时需要选择特定部分的痰液而不是整个样本，一些研究员选择出现上皮细胞的部分，或考虑细胞数量，但是这些都涉及阈值没有在研究背景下很好的阐述，或者过于主观，可能会引起偏倚。
当痰液不能自主产生的时候，可以人为诱导痰液。这个流程涉及到吸入高渗盐水，让病人吹气、咳凑。一些研究比较自然咳出和引诱出痰液的区别，有关于二者能否互相替换的冲突数据。本书建议区分二者，因为 尽管样本类型决定取样微生物组的部分，盐水的稀释度、口腔感染等仍会有影响。
3.手术切除样本
没有任何咽部感染的可能，有自己的方法学限制，病人在手术前会吃抗生素预防手术后感染，即使在健康状态也会影响肺部微生物，肺切除术需要全身麻醉和气管内切除术插管，围手术期可能会吸入咽部分泌物。
因此使用手术切除样本进行肺部微生物研究时，需要采取一些步骤最大化细菌信号，手术切除样本的取样面积比BAL（3~4平方米的粘膜灌洗液）小，组织体积较小提取的细菌信号会很弱，会导致二类错误；不能使用组织固定剂如甲醛，会降解DNA。
4.移植肺
全肺是最理想的样本类型，但是很难获得，且得到的都是疾病末期的，没有疾病发展中期的信息，不适合移植的肺不一定能代表真正健康的肺，适合移植的肺没有及时移植的其菌群可能会发生变化。取样时更能控制无菌。
5.喉咙和鼻咽swab
取样于后咽，临床上用于CF和疑似病毒感染的呼吸道病原检测，在呼吸道微生物组学的研究中国，此取样方法多用于儿童，使用不了支气管镜检和痰液取样。
研究者并没有假设口咽微生物组能够替代LRT，但仍能提供相关的信息，考虑到：1.LRT的微生物群会通过咳凑和粘液纤毛清除而上移；2.一些呼吸道病原菌在导致LRT感染时先在URT“定居”3.普遍存在口咽分泌物通过亚临床微吸入的方式进入LRT。由于这些原因，在一些大样本呼吸道微生物组取样时，可作为一个便宜、可重复、非侵入的选项。
Swabs能代表粘膜微生物，是一种低风险、少入侵的方法，可用于婴儿鼻腔取样；与口腔取样相比，鼻腔取样得到的微生物量较少，需要有特殊考虑降低污染。
6.气管内吸出物
可用于在ICU中机械通气的病人，通过病人气管内管道靶向吸出，不涉及肺泡空间，也是一种便宜、可重复的LRT取样方法。目前没有研究比较BAL和气管内吸出物，但是基于解剖学和微生物学考虑，这两者可能混合了LRT微生物（由于黏液纤毛清除）和URT微生物（由于口咽微生物的吸出）。
已经有研究表明，能在重症病人中研究呼吸道微物的动态性。特定的取样策略（如保护性的伸缩导管）会影响气管内管道生物膜，从而对结果产生影响
7.呼气凝结
一项关于绵羊微生物的研究表明，呼吸凝结中包含的细菌DNA量要远远少于同时的保护性样本刷取样，检测的taxa不与LRT细菌相似。目前没有数据支持呼气凝结用于肺部微生物研究。
四.取样大小
需要考虑合适的取样大小，能提供足够的统计学力度。
general principles：
首先，统计力度测定依赖于 一致连贯的假设，不能说A和B的肺部微生物组不同，过于含糊。一个假设需要包含微生物组关键特征的具体比较：细菌载量、 \alpha 多样性、 \beta 多样性。
一旦关键比较确定了，就可以决定统计力度，取决于初始变量的特征，细菌载量和 \alpha 多样性会被认为是连续变量，假设在不同的数据集中均值有差异；对于\beta 多样性的样本大小估计（如 A和B的群体组成差异）更具挑战，已经有合理的方法做成R包。
调查多个预测因子、潜在的干扰因子和结果时需要增加样本量，并与多重变量模型合并。
我们认为以前的肺部微生物研究样本量不足，特别是考虑到对于疾病样本的观察研究的简便样本，存在不同个体间微生物群的异质性和不可避免的干扰因素（如抗生素、免疫抑制剂）。 |
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发表于 2022-9-20 09:09:22