Nature | RHOJ是EMT肿瘤细胞耐药性的关键调节剂！

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上皮间充质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition，简称EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。癌症中的EMT控制肿瘤的开始、进展、转移和对抗癌疗法的耐药性。促进EMT的转录因子，如Zeb1、Zeb2和Tist1，介导不同癌细胞系在体外和移植到免疫功能低下小鼠后对化疗和放疗的耐药性。然而，EMT诱导的体内原发性肿瘤治疗耐药的机制仍不清楚。
近日，比利时布鲁塞尔自由大学的Cédric Blanpain教授在《Nature》上发表了题为“RHOJ controls EMT-associated resistance to chemotherapy” 的报道。



在该研究中，他们使用呈现自发EMT的鳞状细胞癌（SCC）的遗传小鼠模型来确定不同细胞群对化疗的功能反应，并确定了一种小型Rho GTP酶——RHOJ。RHOJ是EMT肿瘤细胞耐药性的关键调节剂，促进了DNA修复并防止化疗诱导的细胞死亡。

SCC中与EMT相关的化疗耐药性

为了评估EMT是否与皮肤SCC的化疗耐药性有关，研究者使用了Lgr5creERKrasG12DTrp53cKORosa-YFP小鼠，并用顺铂和5-氟尿嘧嘧啶（5FU）进行了治疗，这是用于治疗转移性SCCs人类患者的标准化疗。大约14%的SCC对化疗非常敏感，在治疗4周后完全消失。大约32%的SCC在化疗期间没有反应和进展。大多数SCC（54%）对化疗有部分反应。使用免疫染色和荧光激活细胞分类（FACS）分析，发现反应肿瘤由表达上皮标记K14的YFP+上皮肿瘤细胞或上皮和EMT肿瘤细胞的混合物组成。没有反应的肿瘤被浓缩为EMT肿瘤细胞（K14-VIM+或EPCAM-）。
这些数据表明，化疗要么优先杀死EPCAM+肿瘤细胞，要么诱导EMT在化疗期间促进从EPCAM+到EPCAM-肿瘤细胞的转换。数据表明，皮肤SCC中的EMT与细胞对遗传毒性药物的耐药性有关。



RHOJ介导与EMT相关的治疗耐药性

为了定义EMT肿瘤细胞对化疗产生抗药性的机制，研究者评估了来自皮肤SCCs的EPCAM+和EPCAM-肿瘤细胞中对治疗耐药介质的表达。EMT肿瘤细胞表达了更高水平的凋亡抑制剂（Birc2，Birc3）、谷胱甘肽代谢相关基因（Gpx3，Gpx7，Gpx8，Gstm2）和ABC多药转运体（Abcb1a，Abcb1b，Abcg2）。
此外，RHOJ——Cdc42亚家族的小型GTPase，之前被描述为介导黑色素瘤的抗药性——在EMT肿瘤细胞中表达水平要高得多。Rhoj KO略微减少了每只SCCs小鼠的肿瘤数量，并增加了其潜伏期，这表明RHOJ促进了SCC的启动。Rhoj缺失后，EPCAM+与EPCAM-肿瘤细胞的比例保持不变，表明RHOJ不控制EMT本身。在没有化疗的情况下，与Rhoj-KO EPCAM-肿瘤相比，Rhoj-WT EPCAM-肿瘤的生长速度更快，与它们各自的体外生长一致。顺铂/5FU给药后，Rhoj-WT EPCAM-肿瘤继续生长，尽管比没有化疗时更慢。相比之下，在顺铂/5FU治疗的3周内，Rhoj-KO EPCAM-肿瘤的大小是稳定的，显示Rhoj缺失后对化疗的短期和长期敏感性。



RHOJ控制的转录组和蛋白质组

为了定义RHOJ如何促进EMT肿瘤细胞对治疗的抗性，首先对肿瘤细胞进行了批量RNA测序（RNA-seq）分析。在Rhoj KD的EPCAM-细胞中，487个基因被下调，460个基因被上调。基因本体分析（GO）显示，在Rhoj-KD EPCAM-细胞中下调的基因参与DNA复制、细胞对干扰素的反应和肌动蛋白重塑，而与细胞粘附、脂质代谢、凋亡以及微管和肌动蛋白细胞骨架有关的基因在Rhoj-KD EPCAM-细胞中上调。为了确定RHOJ对EMT肿瘤细胞中蛋白质表达的影响，还进行了蛋白质组学分析。Rhoj-KD肿瘤细胞表现出核蛋白、肌动蛋白调节剂、谷胱甘肽代谢和参与DNA复制的蛋白质的表达减少。相比之下，与内质网代谢过程、胆固醇代谢和凋亡有关的蛋白质在Rhoj-KD肿瘤细胞中受到上调。



RHOJ促进EMT肿瘤细胞的DNA修复

为了确定RHOJ是否通过促进DNA修复和/或对受损DNA的复制耐受来抑制EMT肿瘤细胞凋亡，研究者首先调查了Ser139（γ-H2AX）磷酸化的组蛋白2A.X水平，这是化疗后DNA损伤的标志。与EPCAM+和EPCAM- Rhoj-KO肿瘤细胞相比，EPCAM-H2AX在服用顺铂/5FU后显著减少，支持RHOJ防止EMT肿瘤细胞中DNA损伤积累的概念。在DNA损伤部位聚集53BP1是DNA损伤反应DDR的早期事件。在服用顺铂12小时后，与EPCAM+和EPCAM- Rhoj-KD细胞相比，EPCAM-肿瘤细胞中53BP1核灶更丰富。RPA2焦点的形成与损伤部位的DNA末端切除和复制有关。DNA损伤后的RAD51焦点形成与双链断裂的同源重组介导了DNA修复有关。与EPCAM+和EPCAM- Rhoj-KD细胞相比，EPCAM-细胞中RPA2和RAD51核灶的数量较低。

RHOJ活性DNA复制的新起源

EPCAM+和EPCAM-细胞的细胞周期概况在未经治疗的情况下具有可比性，而Rhoj-KO EPCAM-肿瘤细胞以牺牲S期为代价，G0/G1增加。与化疗后EPCAM+和Rhoj-KO EPCAM-细胞相比，在EPCAM-肿瘤细胞中观察到CDKs（包括CDK1和CDK4）的激活率更高，这表明RHOJ使EMT肿瘤细胞能够在细胞周期中进展，并在化疗后继续DNA合成。

RHOJ调节核肌动蛋白聚合

为了了解RHOJ如何调节DNA修复和化疗后DNA复制起源的激活，研究者试图识别EMT肿瘤细胞中与RHOJ相互作用的蛋白质。在未经处理的条件下和顺铂/5FU给药后12小时，使用EPCAM-细胞的抗HA下拉下表达3HA标记的RHOJ，然后进行亲和力纯化，然后进行质谱法（AP-MS）。结果确定了在未经处理的HA标记RHOJ表达细胞中显著富集的118种蛋白质，以及在处理的HA标记RHOJ表达细胞中显著富集的98种蛋白质。其中，研究者发现了之前确定的RHOJ相互作用的蛋白质，如GPRC5A21。值得注意的是，在化疗后，存在与肌动蛋白丝动力学（FLNB和TLN1）和IPO9（一种调节肌动蛋白核进口的蛋白质）有关的蛋白质。HA标记-RHOJ表达的肿瘤细胞的免疫染色显示了RHOJ的细胞质、核周围和核定位。
这些发现表明，RHOJ与核肌动蛋白调节剂进行物理交互。核肌动蛋白已被证明可以调节DNA复制和修复，IPO9的KD已被证明可以减少核肌动蛋白丝并损害DNA修复。共同免疫沉淀实验证实了RHOJ蛋白复合物中存在IPO9，这表明RHOJ通过调节核肌动蛋白功能来调节化疗后的反应。
总而言之，该研究发现了RHOJ在呈现EMT的肿瘤细胞中过度表达，并确定了RHOJ在调节EMT肿瘤细胞对化疗的耐药性方面的关键作用，揭示了RHOJ促进EMT肿瘤细胞化疗耐药性的机制，这对制定克服抗癌治疗耐药性的新策略具有重要意义。