Nature | 抑制肿瘤转移的新通路——STING！

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转移是癌症死亡的主要原因，通常在休眠一段时间后发生，持续时间长达数月到几十年，具体取决于肿瘤的类型。癌细胞的播散会带来肿瘤转移，而这些细胞在原发肿瘤治疗成功后仍处于休眠状态，在免疫逃避静止状态和易于免疫介导消除的增殖状态之间波动。免疫介导的消除已成为防止休眠癌细胞重新进入细胞周期的重要屏障。对于被重新唤醒的转移细胞的清除以及如何在治疗上激活这一过程以消除患者的残留疾病，目前人们对此知之甚少。



近日，美国斯隆—凯特林癌症研究所Joan Massagué教授团队在学术杂志《Nature》上发表了题为“STING inhibits the reactivation of dormant metastasis in lung adenocarcinoma” 的报道。



在该研究中，他们发现干扰素基因刺激因子（STING）通路是转移爆发的抑制因子，STING为防止休眠癌细胞转移的进展提供了一个检查点，并为预防疾病复发提供了一种可治疗的策略。

免疫控制下的休眠模型

为了确定休眠转移爆发的免疫抑制因子，研究者将来自早期肺腺癌（LUAD）的肿瘤细胞接种到小鼠的动脉循环中，以填充至不同器官。在这些器官中，转移潜伏数月，很少自发爆发。研究者之前分离了来自H2087 I期人类LUAD细胞，建立了H2087-LCC模型。当接种到缺乏T细胞的Foxn1nu无湿性裸鼠时，H2087-LCC细胞填充肺部、肝脏、骨髓和肾上腺，但仍然是静止的单细胞和小增殖簇，很少形成大肿瘤。尽管只有一小部分携带H2087 LCC的小鼠发生了转移，但当用抗唾液酸-GM1抗体处理以耗尽NK细胞时，几乎所有小鼠都发生了多器官转移。
为了建立休眠转移的完全免疫活性模型，研究者通过Cre重组酶在KrasLSL-G12D/+;Trp53flox/flox（KP）小鼠中启动了LUAD肿瘤，并从早期LUAD病变（KPad1细胞）中获得了细胞培养种群。当注射到具有合成免疫能力的C57BL/6小鼠或C57BL/6衍生的B6白化小鼠中时，与源自侵袭性KP-LUAD肿瘤的细胞（KP-482T1细胞）相比，KPad1细胞显示出惰性转移表型。播散的KPad1细胞保持为单细胞或小簇（<20个细胞），其中大多数在接种后25或75天通过Ki67染色确定为静止。因此，免疫监测限制了H2087-LCC和KPad1模型中休眠转移的进展。



筛选发现转移抑制剂

研究者使用了针对H2087-LCC和KPad1细胞中各种免疫激活因子的sgRNA库，在体内进行了集中的CRISPR筛选。收集休眠的H2087-LCC细胞与自发爆发时的H2087-LCC培养物，进行单细胞测序（scRNA-seq）。基因集富集分析（GSEA）将重新唤醒的细胞与自发爆发的细胞进行比较，发现与免疫调节相关的转录特征的选择性富集，包括重新唤醒细胞中的干扰素-α（IFNα）、IFNγ和补体通路。几个sgRNA池增强了H2087-LCC和KPad1细胞向多个器官的转移活性，这表明这些途径中一个或多个基因的功能丧失足以允许重新唤醒的休眠癌细胞的转移进展。为了识别这种转移爆发的候选sgRNA，研究者从单个器官中分离出基因组DNA，然后进行下一代测序来量化sgRNA富集。
值得注意的是，与STING途径（STING、IFNB1和CCL5）和STING下游的干扰素响应基因（IFI27和IFITM3）相关的多个基因是H2087-LCC和KPad1屏幕中排名最高的sgRNA靶点。针对STING和IFNα途径的sgRNAs也在KPad1肺定殖筛选中得分，进一步指出这些途径是LUAD中休眠转移退出的候选抑制剂。

在重新唤醒的细胞中激活STING

STING途径在癌症细胞和感染病毒或细菌的细胞中触发对胞浆dsDNA的固有免疫反应。胞浆dsDNA与环GMP–AMP合酶（cGAS）结合，后者产生第二信使cGAMP。癌症细胞含有大量的胞浆dsDNA和cGAMP。值得注意的是，与静止的单细胞相比，携带播散的H2087-LCC或KPad1细胞的小鼠肺或脑切片的免疫染色显示，单个增殖性转移细胞和小簇中STING和STING诱导的趋化因子CCL5的水平更高，而大转移瘤中STING的水平和CCL5水平更接近休眠细胞，表明在最近重新唤醒的转移细胞中STING表达和通路活性增加。
研究者分析了II期或III期LUAD患者淋巴结中STING和CCL5的表达，这些患者的淋巴结中含有小簇播散性癌症细胞。增殖型（Ki67high）播散型癌症细胞的STING和CCL5免疫荧光强度高于静止细胞，而患者源性大转移瘤的STING和CCL4表达低于其匹配的原发肿瘤，所有这些都与在休眠转移小鼠模型中的发现相一致。对患者来源的LUAD大转移瘤的scRNA-seq数据的分析表明，与来自相同病变的SOX9+细胞相比，这些病变中存在的SOX2+早期祖细胞表达高水平的STING、典型STING靶点、IFNα反应基因和NF-κB靶基因。
数据表明，转移性SOX2+祖细胞从休眠状态向增殖状态的转变伴随着STING活性的增强，并且随着大转移瘤在免疫选择压力下的发展，分化程度更高的SOX9+祖细胞下调STING。这表明STING表达的下降与免疫监测下病变的发展有关。





STING激活能够抑制转移

为了确定STING对转移进展的影响，分别在H2078-LCC和KPad1模型以及它们的侵袭性对应物H2030和KP-482T1中进行了必要性和充分性实验。自发转移爆发的细胞（H2087-LCC-SO细胞）显示出低STING表达，并且外源性cGAMP没有诱导IFNB1表达。相反，在具有强力霉素诱导的STING过表达的H2087-LCC-SO细胞中，将这些细胞接种到无胸腺小鼠中7天后给予强力霉素增加了无转移生存时间。TING对KP-482T1转移的抑制作用取决于NK细胞和CD8+ T细胞，因为小鼠中这些细胞群的抗体介导耗尽消除了STING的影响。细胞培养上清液的分析证实，KP-482T1细胞中的STING过度表达诱导了CCL5、CCL20、CXCL10和其他促炎因素的分泌，这些因素与先天性和适应性免疫细胞的招募和激活有关。
在H2087-LCC模型中，STING敲除不影响NK细胞介导的直接杀伤的功效，但抑制了NK细胞的迁移能力。总的来说，这些结果表明，癌细胞内在STING激活通过促进NK细胞和T细胞的浸润来抑制LUAD转移。



STING下调的基础

KRAS-LKB1-突变肺癌细胞系中报告了STING启动子的超甲基化。在两个独立的H2087-LCC自发爆发细胞群（SO1和SO2）中，以及在H2030和A549细胞中观察到STING启动子和3′增强子上的DNA超甲基化。DNA甲基转移酶（DNMT）结合的ChIP–PCR分析显示，在H2087-LCC-SO1和SO2以及H2030和A549细胞中，DNMT3B与STING启动子和3′增强子的结合更高。用DNMT抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（地西他滨）处理H2087-LCC-SO1、H2087-LCC-SO2、H2030和A549细胞挽救了这些细胞中STING的表达。TGFβ是乳腺和头颈癌转移休眠的诱导剂，TGFβ在休眠期间通过增强子抑制下调STING表达；以及启动子和增强子的DNA甲基化在转移性疾病爆发中下调了STING表达。





利用STING预防转移

研究者使用了苯并噻吩氧代丁酸（MSA-2），一种具有抗肿瘤作用的非核苷酸STING激动剂。MSA-2体外处理增加了野生型KPad1和H2087-LCC细胞中STING靶基因CXCL10和CCL5的表达。将野生型或STING敲除的KPad1细胞接种到同基因免疫活性小鼠中，将H2087-LCC细胞接种到无胸腺裸鼠中，让播散的细胞在远处器官中沉淀一周（KPad1）或两周（H2087-LC），然后在每个模型的休眠期内开始每周用MSA-2治疗两周（KPada1）或四周（H2087-LCC）。MSA-2治疗导致播散性KPad1癌症细胞的STING依赖性耗竭，MSA-2增加了接种STING未敲除 KPad1细胞的小鼠的无转移和总生存率。数据表明，MSA-2治疗降低了转移的发生率，这种效果依赖于癌症细胞中的STING。



研究结果揭示了STING信号在休眠播散LUAD细胞和抗肿瘤免疫之间的相互作用，防止这些癌细胞从惰状态进展到侵袭性转移。目前STING激动剂的临床试验是在晚期肿瘤的背景下进行的，在晚期肿瘤中，该途径发挥着复杂的作用，包括促进抗肿瘤免疫反应、癌症细胞衰老和凋亡，并通过NF-κB信号传导在一些模型中诱导促癌效应。
这些不同的作用可能会使STING激动剂在已确定肿瘤中的试验结果复杂化。然而，休眠转移微环境与晚期转移微环境有很大不同。因此该观察结果值得进一步研究，以便在辅助环境中合理利用免疫系统。