非肿瘤生信怎么做？8+单细胞揭示非肿瘤免疫思路解析

徐政

题目：Single-cell RNA-Seq reveals changes in immune landscape in post-traumatic osteoarthritis
发表期刊：Front Immunol      IF=8.786



研究发现了几种在前交叉韧带（ACL）损伤后以细胞类型特异性方式诱导或抑制的基因。这项研究为免疫微环境中与创伤后骨关节炎（PTOA）相关的变化提供了新的见解，并强调了可能在损伤后关节修复中发挥作用的巨噬细胞亚型。
小鼠膝关节损伤诱导免疫变化的单细胞水平表征
为了识别各种滑膜关节免疫细胞类型并描述其在PTOA病理进展过程中的动态变化，作者分析了从10周龄BL6小鼠膝关节分离的单个CD45+细胞的RNA在ACL损伤前(D0)和损伤后，在不同的受伤后时间点（D1、D3、D7、D15和D30）（图1A）。还对来自D0的非免疫细胞进行了测序，以研究关节中免疫和结缔组织形成细胞之间的潜在分子相互作用（图1A）。免疫群体分析确定了7个具有不同基因表达谱的主要细胞簇（图1B）。每个簇的身份是根据先前发表的细胞类型特异性标记的表达确定的（图1B）。基于S100a8、S100a9、Mmp9、Retnlg和Ly6g的高表达，簇0被鉴定为中性粒细胞（图1C）。簇1表达单核细胞/巨噬细胞标志物Cd14、Itgam和Csf1r，并被标记为“单核细胞-巨噬细胞(Mono-Mac)”。基于Cd19、Cd79a和Cd79b表达将第2组中的细胞鉴定为B细胞。簇3表达高水平的细胞周期基因Mki67、Cdk1、Stmn1、Top2a和Cenpa；该簇被注释为“增殖细胞（Prolif.cells）”（图1C）。簇4表达T细胞标记Cd3e和Thy1，而簇5表达自然杀伤(NK)细胞的标记，包括Nkg7和Gzma（图1C）。基于DC标记Cd209a和Lag3的表达，第6组被鉴定为DC（图1C）。



图1 10周龄BL6小鼠膝关节损伤诱导的免疫变化的单细胞分析



受伤后，在Mono-Mac集群中观察到最显着的变化，从D0测序的总免疫细胞的约12%增加到D3的约37.5%，然后开始减少（图1D）。与此一致，流式细胞术分析显示损伤后关节中CD45+CD11b+Ly6C+Ly6G-单核细胞/巨噬细胞增加，在D3达到峰值，然后在D30恢复到D0水平（图1D-E)。中性粒细胞和B淋巴细胞的比例在D7时升高，但在D15时，免疫成分与D0非常相似（图1D）。作者观察到在D30时增殖免疫细胞的比例增加，然后在组织学上，关节开始出现明显的退化（图1D，F）。
膝关节损伤后单核细胞和巨噬细胞室发生显着变化
先前的研究已经表征了处于稳态和炎症性关节炎的滑膜巨噬细胞，并表明它们是一个高度异质的群体，具有不同的功能和起源。为了确定Mono-Mac集群内的细胞多样性（图1B）并确定各种巨噬细胞和单核细胞亚型之间的潜在发育关系，作者更详细地检查了Mono-Mac集群。子聚类Mono-Mac导致识别出9个具有不同基因表达谱的聚类（图2A-C）。所有簇都表达Itgam(Cd11b)和Cd14，而Adgre1(F4/80)和Cd68表达在簇0、1、3和5中富集（图2D），表明这些是巨噬细胞。簇0还显示富集Trem2、Fcrls、Ms4a7、Apoe、Fabp5、Cd63和补体途径的几个成员（C1qa、C1qb和C1qc）（图2A-D）；该簇被注释为Trem2hiFcrls+巨噬细胞。作者还在该簇中检测到了稳健的Mrc1(Cd206)表达（图2D），这表明簇0可能代表一组交替激活的巨噬细胞。Trem2hiFcrls+巨噬细胞的比例在受伤后急剧增加，在D3达到峰值，但在D15时显着减少（图2E）。



图2 表征损伤引起的单核细胞/巨噬细胞群的变化



为了确定各种单核细胞和巨噬细胞簇之间的潜在发育关系，作者使用Monocle进行了伪时间分化轨迹分析（图3A）。细胞根据其伪时间值绘制在轨迹上，伪时间值是从谱系起源沿细胞发育谱系推断的距离。在伪时间轨迹开始时发现单核细胞，而表达高水平Mrc1的巨噬细胞群位于另一端（图3A、B）。S100a8hi单核细胞和Hspa1bhi单核细胞占据两个独立的分支，而Ly6c2hi单核细胞分布在这两个分支上（图3A）。作者还观察到Trem2hiFcrls+群体在损伤后D1-D7沿单核细胞→巨噬细胞方向的轨迹显着扩张（图3A）。这种扩张与主要在D1的Ly6c2+细胞、D1-D7的Adgre1(F4/80)+细胞、主要在D3-D7的Mrc1(Cd206)+细胞的增加相吻合（图3C）。此外，作者观察到随着时间在Trem2hiFcrls+簇中Adgre1和Mrc1表达增加，单核细胞标志物Ly6c2和Plac8表达减少（图3D）。这表明Trem2hiFcrls+巨噬细胞群可能起源于Ly6c2+单核细胞，大多数细胞通过D3获得M2样表型（图3A-D）。为了进一步证实这一点，作者从scRNA-seq数据中提取了表达Ly6c2和表达Mrc1的细胞，发现在D1和D3的Trem2hiFcrls+簇中的大量细胞是Ly6c2+细胞，而高比例的细胞是Mrc1+在D3-D7。



图3 D0-D30单核细胞和巨噬细胞的伪时间分化轨迹分析


作者还鉴定了在这些单核细胞/巨噬细胞亚群中差异表达的几种转录因子(TF)，它们可能在调节其独特的转录组特征中发挥作用。通过在伪时间尺度上绘制TF表达，作者发现TFMxd1和Ets2在分化轨迹的早期表达最高，主要在单核细胞中，而诸如Mafb、Mef2a、Mef2c、Klf4和Tcf4等TF在接近末期的表达最高伪时间轨迹，主要在Mrc1+巨噬细胞亚型中（图3F）。Etv1和Maf主要在Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞中表达，而Irf7是I型干扰素依赖性免疫反应的关键调节因子，在IFN-RMono-Mac中显着富集（图3F）。
Lyve1标记具有潜在合成代谢功能的常驻巨噬细胞
Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞在包括D0在内的所有检查时间点都是主要的Mono-Mac群体，并且该群体强烈表达Mrc1(CD206)和Cd163，替代激活巨噬细胞的标志物(图4A)。作者观察到Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞在损伤后没有像其他巨噬细胞亚型一样沿分化轨迹显示扩张，这表明它们没有从单核细胞主动分化。巨噬细胞中的Ccr2表达与单核细胞起源相关，并且已经表明Ccr2-巨噬细胞不被单核细胞补充。作者发现Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞的Ccr2表达最小，而所有其他簇都强烈表达Ccr2（图4B）。这表明Lyve1hiFolr2hi簇可能代表自我更新的组织驻留巨噬细胞。IHC分析表明Lyve1high巨噬细胞主要存在于D0的滑膜内层并表达CD206，表明它们具有M2样表型（图4C-D）。Lyve1+巨噬细胞的整齐排列被破坏，这些细胞的空间方向在小鼠ACL损伤后发生变化（图5A、B），这些细胞开始渗入滑膜（图5A、C、D）。在Lyve1+巨噬细胞中也观察到Trem2受体表达（图5）。



图4 Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞的表征



图5 基于Lyve1表达的损伤诱导的Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞定位变化


基于Lyve1表达的损伤诱导的Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞定位变化
Trem2hiFcrls+巨噬细胞在D15之前是受伤关节中的主要巨噬细胞群，并且似乎来自单核细胞（图2A）。作者发现Trem2hiFcrls+巨噬细胞也显示出对Mrc1和许多在Lyve1hiFolr2himacrophages中高度表达的合成代谢生长因子的富集，包括Igf1、Pdgfa和Pdgfb，这表明这两个群体可能具有相似的功能（图4A）。此外，作者在Lyve1+滑膜巨噬细胞中观察到Trem2的表达（图5）。接下来，作者研究了与所有其他单核细胞/巨噬细胞簇相比，这两种巨噬细胞群中富集的基因。与所有单核细胞、MHCIIhi和Crip1hiCav+巨噬细胞相比，154个基因在Trem2hiFcrls+簇中富集>1.25倍。其中，111个基因也在Lyve1hiFolr2hi簇中富集（图6A）。除生长因子外，Trem2hiFcrls+和Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞共有的基因包括Trem2及其配体Apoe、Dab2、Stab1、Ms4a7、组织蛋白酶（Ctsb、Ctsd和Ctsl）、补体途径基因C1qa、C1qb和C1qc以及Mmp抑制剂Timp2（图6B，C）。与Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞相比，作者还发现了许多富含Trem2hiFcrls+巨噬细胞的基因。这些包括抗炎细胞因子Il10、Spp1、Gpnmb、Fabp5、Mmp14和Mmp19（图6D）。作者的研究还揭示了在损伤后不同时间点在Trem2hiFcrls+巨噬细胞中激活的基因。包括Spp1、Ccr2、Fabp5和Mmp8在内的基因在D1时升高，而Igf1在D7时表达最高（图6E）。M2巨噬细胞的标记Arg1在D1和D3显着上调，但在D7显着降低。与Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞相似，Ctsa、Ctsb和Ctsc在D3时具有峰值表达。补体途径基因的表达也随时间增加（图6E）。作者还观察到Trem2hiFcrls+簇内的显着异质性。一个细胞亚群显示出转录因子如Jun和Fos的显着富集，而另一个细胞亚群显示出对细胞因子如Cxcl2和Il10的富集。



图6 使用scRNA-seq表征Trem2hiM2样巨噬细胞



TREM2（在骨髓细胞上表达的触发受体2）是一种细胞表面受体，在骨髓谱系细胞（例如脑中的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞和小胶质细胞）中表达。作者发现Trem2及其配体Apoe在M2样Trem2hiFcrls+和Lyve1hiFolr2hi巨噬细胞群中大量表达（图6B）。Trem2和Apoe先前已被证明在吞噬作用中发挥作用，并且Trem2+巨噬细胞与多个器官的组织修复反应有关。为了确认M2样巨噬细胞中Trem2的表达，作者对D0和D7的滑膜巨噬细胞进行了流式细胞术分析。流式细胞术分析显示，关节中>85%的M2样巨噬细胞（CD45+CD11b+F4/80+CD206+）表达Trem2（图7A-C）。与scRNA-seq数据一致，与未受伤的D0关节相比，D7受伤的关节具有明显更多的Trem2+M2样巨噬细胞，而D0关节的巨噬细胞主要是Trem2-CD206-（图7D）。为了确定Trem2是否在M2巨噬细胞分化中发挥重要作用，作者使用流式细胞术分析了来自野生型(WT)和Trem2缺陷小鼠(Trem2-/-)的未受伤和受伤关节的巨噬细胞。M2巨噬细胞的比例在这些小鼠之间没有显着差异，但是对来自WT和Trem2-/-小鼠未受伤和受伤关节的细胞的大量RNA-seq分析确定Trem2-/-小鼠的表达显着降低与WT相比，D7时的Cx3cr1、Ptprc、Adgre1、Csf1r、Havcr2、Ldlr、P2y12、Fcgr1和Fcgr3（图7E）。Fcgr1、Fcgr3和P2y12在吞噬作用中发挥作用，而Cx3cr1和Csf1r等基因则参与巨噬细胞分化、募集或激活。Trem2-/-小鼠中这些基因的下调表明损伤后巨噬细胞反应发生了改变，并表明Trem2信号传导可能通过调节巨噬细胞活化和吞噬作用在关节修复中起主要作用。



图7使用流式细胞仪表征表达Trem2的巨噬细胞

中性粒细胞和淋巴细胞的表征
中性粒细胞是在所有检查时间点鉴定的最丰富的免疫群体（图1B-D），并且似乎是基质降解酶（如Mmp8和Mmp9）和几种细胞因子（包括Il1a、Il1b、Cxcl2、Cxcl3和Ccl3）在关节中的主要来源（图8A）。对中性粒细胞簇细胞的进一步分析揭示了具有不同基因表达谱的4个主要亚型：（1）Ccrl2hi中性粒细胞表达高水平的Ccrl2、Il1b、Ptgs2和Cxcl2；（2)Mmp8hi中性粒细胞富含Mmp8、Mmp9、Retnlg和Ly6c2；（3)Chil3hi嗜中性粒细胞具有高表达Chil3、Ngp和Lcn2和（4)干扰素(Ifn)反应性嗜中性粒细胞表达高水平的Ifit1和Isg15（图8B，C）。作者还鉴定了损伤后中性粒细胞簇中上调的几个基因，包括制瘤素M(Osm)、Ptgs2、Mmp8、Mmp9和Adam8（图8D）。T、NK和DC簇在作者的数据中的代表性不足，这使作者无法识别这些细胞类型中由损伤引起的显着变化。B细胞簇分析揭示了四种B细胞亚型，均表达Cd79a（图8E-G）。有趣的是，其中一种B细胞亚型表达粒细胞标志物Lcn2、Retnlg和Mmp8，并被标记为Lcn2hiB细胞样细胞（图8E-G）。作者发现损伤后该簇中炎性细胞因子和基质降解酶表达显着增加（图8H）表明Lcn2hiB细胞样细胞也可能有助于PTOA发病机制。



图8 中性粒细胞和B淋巴细胞的表征

总结
作者的研究揭示了包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和B细胞在内的各种免疫群体中转录反应的异质性，这是传统的大量RNA-seq或其他基因以前没有意识到的表达分析方法。中性粒细胞被确定为炎性细胞因子（包括Il1a和Il1b）和基质降解酶（包括Mmp8、Mmp9和Adam8）的主要来源，这表明这些细胞在关节、损伤后的持续存在可能显着影响PTOA的发展。作者还观察到关节中有大量的B细胞。有趣的是，作者发现了一种同时表达B细胞和粒细胞标志物的B细胞亚型（图8E-H）。该簇还显示出损伤后细胞因子和蛋白酶表达的增加，并且也可能有助于OA发病机制。

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