【文献解析】肿瘤耐药性到底怎么研究？这篇综述也许能给你 ...

感悟顿觉

撰写：米妮 来源：小张聊科研平台的“科研讲坛”公众号，微信公众号搜索“科研讲坛”即可关注见文末



过去的几十年里，我们见证了治疗癌症——分子靶向治疗的飞速发展和演变，但在靶向癌症治疗中会出现“持久耐药性”细胞，它一直是影响癌症患者预后的最大挑战。如何消除这些“持久性耐药细胞”来改善癌症患者的预后呢？今天带你解读的这篇综述文献，Emerging Insights into Targeted Therapy-Tolerant Persister Cells in Cancer，带您从单细胞水平上了解持久耐药性细胞特征到深度剖析耐药性相关机制，将启迪您获得潜在治疗这种“持久耐药性”细胞的机会。




                                                                             背景知识


                                                                       图1
癌症靶向治疗的耐药性分为原发性或获得性（如图1A）。

原发性耐药是指初始治疗就出现癌症逃避。临床上，指在开始治疗后肿瘤没有缩小的无反应者，被认为是由于预先存在的基因突变或未经治疗的肿瘤内耐药细胞状态引起的内在耐药性，或细胞快速适应治疗的能力，即适应性抵抗。

获得性耐药指对最初对治疗有反应的肿瘤在进行长期治疗后出现的耐药性。目前对获得性耐药机制有两种看法，预先存在的或重进化得到。肿瘤内的存在潜在克隆异质性，罕见的亚克隆可能在治疗开始之前就具有获得性耐药机制。靶向治疗初始应答的期间这些抗性细胞不断扩大，最终由于药物抗性机制驱动肿瘤复发。或细胞可以在最初的药物治疗中通过表观遗传适应存活下来，从而在永久性耐药性出现之前产生耐药性、循环缓慢的表型，这些肿瘤亚群可以通过进入“持续”耐药性状态来选择性逃避药物压力，然后可以作为细胞库，从中可以出现进化出真正耐药的克隆。
                                                                     持久耐药细胞的起源与特征
                                                                                 持久性细菌


                                                                   图2

药物耐受持久性起源抗生素发现不久之后。1942 年，Gladys Hobby 观察到，虽然青霉素能够杀死绝大多数培养的链球菌细胞，但仍有约 1% 的细胞保持完整。1944 年，约瑟夫·比格 (Joseph Bigger) 对存活的细菌进行了表征并命名为“持久性细菌”。最近，活体成像实验证实，这些在抗生素治疗中存活下来的细菌在添加抗生素之前确实没有增殖。此外，在停药后，这些在抗生素治疗中存活下来的耐药慢循环细菌可以恢复到增殖状态并重新建立一个药物敏感群体，这表明细菌耐药的持久性是短暂的，并且是由表型可塑性而不是基因改变介导的（图2A）。
癌症中的持久性
2010年，Settleman 及其同事将持久性的概念扩展到癌症领域，以描述用靶向疗法治疗的癌细胞。使用具有致癌性 EGFR 外显子 19 缺失的人类 NSCLC 细胞系 PC9，他们观察到用致死剂量的 EGFR 抑制剂厄洛替尼治疗后占原始约 0.3% 的一小部分细胞存活下来。他们将这种细胞称为缓慢循环的静止药物耐受持久性细胞 (DTP)的亚群。随着时间的推移，在厄洛替尼存在的情况下，一部分 DTP 重新开始增殖，产生了第二批标记为耐药扩展·持久性细胞 (DTEP)。与细菌持久性相似，从药物中去除DTEP后恢复到药物敏感状态。作者还测试了其他细胞系，包括肺癌、黑色素瘤、结直肠癌和乳腺癌细胞系，并观察到在接触各种药物（顺铂、EGFR 抑制剂、RAF 抑制剂和 MET 抑制剂）后生成了类似的耐药持久性细胞亚群。因此，一种耐药性癌症的癌细胞亚群广泛存在于肿瘤衍生细胞系中，并在接受靶向治疗后出现（图2B和图3A）。



                                                                             图3

在癌症中，术语“持久性（persister）”没有明确的生物定义，该术语与其他术语如宽容[可互换使用，休眠，或静态，指的是在长期药物治疗中存活的癌细胞亚群]。一般而言，这些细胞群状态介于敏感状态和抗性状态之间，这是药物治疗期间细胞存活但不完全增殖或抗性的时期。与耐药性相反，耐药持久性细胞对药物“耐受”，因为药物不会诱导细胞死亡，但仍然发挥抑制作用。在临床上，这对应于肿瘤最大程度消退之后，在继续治疗时，肿瘤生长之前的时间段（图3C）。

目前尚未确定耐药持久性细胞和完全耐药肿瘤进展的关系。但持久性在癌症中存在几个共同特性。第一：持久性细胞构成了一小群细胞，尽管暴露于药物，它们仍然可以存活。而耐药肿瘤细胞的一个特征是逃避药物诱导的细胞凋亡。第二：持久性细胞缓慢循环、或者称为休眠/静止，细胞数几乎没有增长。进入以缓慢循环为特征的静止或休眠状态可能会促进新陈代谢和其它存活机制的变化，从而使癌细胞能够在长时间暴露于药物的情况下存活。有趣的是，这种休眠状态可以与细胞衰老共享特征，表达衰老的标志。第三个：通过观察到药物耐受状态在去除药物后是短暂的和可逆的，让人联想到细菌持久性，表明癌细胞持久性存在机制是非遗传性的。与由 DNA 损伤性化疗药物治疗引起的衰老不同，癌细胞似乎在接受靶向治疗后最常表现出可逆的药物耐受状态。耐药持久性状态的这种可逆性表明潜在的表观遗传机制。在某些情况下，药物耐受的表观遗传机制与干细胞标志物的表达一致，表明持久性细胞可能具有癌症干细胞的特征。

                                                                    耐药持久性细胞的起源

鉴于持久性细胞可能是获性耐药性细胞的来源，了解持久性细胞是如何产生的可能有助于指导治疗策略以靶向它们并预防或延缓耐药性的发展。研究已经表明，即使在治疗之前，耐受药物的持久性细胞群或准备持久存在的癌细胞就已经存在，研究支持一个模型，其中预先存在的耐药肿瘤细胞亚群在药物治疗后富集，类似于非遗传达尔文选择的原则。换句话说，预先存在的异质性提供了选择的基础，而不是可塑性。基于预先存在的转录变异性和多个抗性基因的同时表达对细胞亚群的初始选择后是药物诱导的表观遗传重编程，将瞬时转录状态转换为稳定的抗性状态。

耐药持久性细胞：耐药机制和治疗脆弱性
目前对在不同药物暴露中存活的耐药持久性细胞机制的理解主要集中在利用患者来源的细胞系或体内异种移植模型的体外研究上（图 3A、B)，其中药物滴定可以允许选择耐药持久性细胞。作者总结了过去和最近研究药物耐受性机制的基础研究（见表格1）。





表观遗传重编程
当耐药状态在功能上是异质的、不断进化的和短暂的时，表观遗传重编程可能是至关重要的，这与基因突变导致的稳定耐药性形成对比。肿瘤可以显示出不断演变的表观遗传景观，包括 DNA 启动子区域的改变、组蛋白乙酰化或甲基化失调、重复元件表达失调。许多研究现在提供了令人信服的证据，表明癌细胞可以通过表观遗传机制获得药物耐受状态，从而对治疗产生耐药性，反过来表观遗传重编程是可以逆转的。如在大量 EGFR 突变的 NSCLC 细胞群中，RNA 测序揭示了药物诱导的 LINE-1 元件和 IFN 反应/抗病毒反应基因在 TKI 治疗后的表达增加。然而，在耐药持久性细胞（DTP）中，H3K9 甲基化在 LINE-1 元件处积累，阻止了药物治疗后表达的增加，从而促进细胞存活。用组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂治疗会破坏 H3K9 甲基化依赖性异染色质的形成，从而抑制 DTP 中的 LINE-1 元件并重新诱导细胞死亡。因此，通过表观遗传重塑抑制性染色质环境强制重复元件的抑制可能给持久性细胞提供逃避治疗的毒性后果。

旁路和替代信号通路的激活
旁路信号通路的激活是癌症靶向治疗获得性耐药的常见机制，将原发癌基因靶向药物与紧急阻断耐药诱导旁路的药物相结合的治疗策略正在耐药患者中进行临床测试。例如，在耐药 EGFR 突变肺癌亚组中发现 MET 扩增，EGFR 和 MET TKIs 的组合有希望在因 MET 扩增而获得性耐药的 EGFR 突变肺癌患者中起作用。以此类推，外源性生长因子激活受体酪氨酸激酶旁路信号通路，可以降低癌细胞对靶向癌基因的依赖性，促进药物耐受。此外，越来越多的证据表明，涉及谱系和发育途径、先天免疫和应激信号的替代信号通路在耐药细胞的存活中起着至关重要的作用。几项研究表明，一些耐药和耐药状态的特征是 AXL 受体酪氨酸激酶的表达增加，通常与上皮间质转化 (EMT) 相关。与细胞谱系相关的几种信号通路，如 Wnt/β-catenin 通路、RXR 和 Notch 信号通路，也已显示在药物治疗后存活的肿瘤细胞中被激活。Wnt/β-catenin 通路在上皮状态的发展中很重要，包括肺泡 2 型 (AT2) 肺干细胞，可作为肺腺癌的祖细胞。激活癌症中的炎症或先天免疫信号，如 IL-6/JAK/STAT3 轴、NF-κB 和干扰素信号，可以促进肿瘤细胞存活。来自 Sordella 和 Settleman 小组的研究表明在EGFR 突变 NSCLC 模型中，IL-6有促进药物耐受性作用。

抑制细胞凋亡
抑制细胞凋亡是癌症的经典标志之一，也与药物耐受性有关，并且可能是克服药物耐受性的重要治疗靶点。许多研究已经确立了促凋亡 BH3 蛋白 BIM 在介导靶向治疗凋亡反应中的核心作用。Song 等人，观察到抗性间充质 EGFR 突变肺癌由于 BIM 表达缺失而表现出细胞凋亡缺陷，尽管靶向治疗有效抑制了致癌信号，但仍导致细胞死亡。Kurppa等人。观察到，EGFR 突变 NSCLC 模型细胞的联合 EGFR/MEK 抑制选择了一群表现出衰老样特征的休眠耐药细胞，其特征在于高 YAP/TEAD 活性。上皮间质转化（EMT） 转录因子 SLUG 与 YAP/TEAD 合作，减弱药物诱导的促凋亡 BH3 蛋白 BMF 的上调，从而减少药物诱导的细胞凋亡。药物诱导的 BMF 表达和细胞凋亡通过 YAP/TEAD 的药理抑制恢复，导致休眠细胞的存活率降低。

与药物耐受性相关的机制，如EMT，也可能间接抑制细胞凋亡。如 Nilsson等人在EMT EGFR TKI 耐药模型中识别出YAP/FOXM1的激活，这与纺锤体组装检查点 (SAC) 蛋白的失调有关，并使细胞容易受到SAC 抑制剂的影响。

代谢重编程
代谢失调是癌症的一个核心标志，越来越多的证据表明，癌细胞利用代谢重编程来在致癌信号阻断的情况下存活。Roesch 及其同事发现，用多种抗癌药物治疗的黑色素瘤细胞系富含抗性 JARID1B高的黑色素瘤细胞，其参与生物能量代谢的线粒体蛋白表达增加。这表明在治疗期间利用氧化磷酸化能力增强的细胞可能会更好地持续存在。为了实现这一点，细胞可能会重新连接代谢途径，以提供线粒体呼吸继续所需的代谢物。一般而言，癌细胞尤其是持久性细胞中代谢失调的结果之一是活性氧 (ROS) 的产生增加。因此，耐受药物的持久性依赖于抗氧化途径来减轻氧化应激。Raha等人，据报道，用靶向疗法治疗代表肺癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌的各种 DTP 实验模型依赖于醛脱氢酶 (ALDH) 的表达来保护耐受亚群细胞中的高水平的ROS毒性作用。

与肿瘤微环境的相互作用
肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，由多种细胞类型组成，支持肿瘤细胞的生长、促进肿瘤进展并调节抗癌治疗的反应。首先癌症相关成纤维细胞 (CAF) 由于可通过可溶性因子的分泌和细胞与细胞的直接接触，在耐药性形成方面的潜在作用一直被受到重视。通过激活受体酪氨酸激酶和与靶向癌基因相同的下游信号通路的能力，许多可溶性生长因子有能力对抗一系列靶向治疗的作用。原型可溶性微环境因子 HGF 已被证明在许多情况下是由 CAF通过激活 MET 信号通路产生的。其次，肿瘤微环境的一般特征，例如脉管系统的密度和分布，可以通过对营养和氧气水平来影响肿瘤细胞的适应性和随后出现的耐药克隆。在黑色素瘤细胞中，随着氧气水平的变化，观察到增殖状态和药物耐受慢循环状态之间的动态转变。

适应性诱变
提高抗生素暴露后细菌存活的一种机制是瞬时增加其突变率（适应性/可变性）以产生表型多样性，从而增加大量亚克隆的存活概率。新出现的证据表明，癌细胞可能会采取类似的行为。Russo等人，发现用 EGFR 抗体或 BRAF 抑制剂处理的人类结直肠癌 (CRC) 细胞，耐药持久性细胞错配修复 (MMR)和同源重组 (HR) DNA 修复基因，而下调易错聚合酶。在治疗期间，MMR 蛋白在肿瘤标本和患者来源的异种移植物中也被下调。虽然这是否直接导致耐药表型本身，或产生群体异质性，增加某些克隆适应性优势的可能性仍有待澄清，但这些结果表明，肿瘤细胞和细菌之间在逃避治疗的能力存在相似之处。通过增强可变性来逃脱治疗压力。

临床上的持久性
与实验性药物耐受持久性状态最相关的临床类比是接受全身靶向持续治疗的晚期或转移性癌症患者的微小残留病灶 (MRD)（图 3C）。虽然这些患者中的许多人经历了戏剧性的初始肿瘤消退，但这些反应是不完整的，并且通常会在很长一段时间内残留肿瘤病灶在放射成像上出现休眠。虽然获取这些 MRD 病变的组织样本作为常规临床护理的一部分是不典型的，但观察到疾病复发通常发生在这些部位（有时在多年休眠后），这提供了证据，证明活的癌细胞在 MRD 部位持续存在。尽管残留疾病可能继发于多种机制（包括阻止完全靶向抑制的药代动力学问题），但具有上述表型的耐药性持久细胞的存在似乎很可能。目前，结合治疗中活检的临床试验设计为直接研究临床环境中的持久性提供了最佳机会（图 3C）。治疗诱导的持及性状态也可能与休眠癌细胞具有临床相关性，这些癌细胞可以是接受过明确治疗且临床上被认为无病患者的长期复发。例如，在接受局部治疗乳腺癌中，在切除原发肿瘤数年后甚至数十年后，局部或远处器官可能发生晚期复发。这种临床癌症休眠的情况发生在没有继续治疗的情况下，但强化了由缓慢生长的癌细胞驱动的非线性肿瘤生长的概念，这些细胞可能具有类似于耐药性持久细胞存在的特征。目前，我们对在临床微小残留疾病和随后的疾病复发中的耐药持久性存理解受限于在这个时间点获取肿瘤组织进行研究的困难。此外，临床复发肿瘤中的分子特征是否能表明耐药细胞经历了持久性状态这个过程是尚待确定的。

                                                                         总结

在癌症中，这些耐受药物的持久性细胞可能作为各种稳定耐药机制后续进化储存库的前景，使它们成为新疗法的有吸引力的目标。然而，针对持久性细胞的成功策略在很大程度上取决于对特定临床环境中异质细胞亚群中驱动药物耐受性的机制的了解程度。因此，未来工作的一个重要目标应该是优先努力从患者身上微小残留病点获取治疗中的活检。这些研究对于理解持久性的生物学和临床现实是对药物耐受机制和肿瘤细胞持久性，以及实验模型的建模至关重要。此外，这些努力对于剖析肿瘤微环境的也很重要，因为使用体外模型或免疫功能低下小鼠的体内研究无法很好地解决这一问题。单细胞测序方法的不断发展，以及基于组织的分析，如空间转录组学、高度多重免疫荧光和基于质谱的方法，将允许我们更深入地表征耐药持久性细胞以及临床样本中的肿瘤微环境。

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原文链接： （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8198243/）
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