项目文章 | 单细胞测序揭示胶质瘤相关巨噬细胞极化和肿瘤 ...

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2023年1月，南京脑科医院团队在Nature子刊上发表题为“Single-cell RNA sequencing reveals changes in glioma-associated macrophage polarization and cellular states of malignant gliomas with high AQP4 expression”的研究成果。文章发现AQP4表达水平在不同的神经胶质瘤中存在差异，且AQP4表达量提示了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的极化趋势，进而导致胶质瘤恶性细胞的状态变化。
本研究中使用新格元GEXSCOPE®单细胞转录组技术平台进行了文库构建及单细胞转录组测序等工作。

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研究背景

神经胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。胶质淋巴系统是一个由星形胶质细胞上水通道蛋白4(AQP4)介导的促进脑脊液-组织液交换流动的系统，实现脑脊液与组织液的交换，从而清除组织液中的溶质并运输营养物质，与多种神经退行性疾病有关。AQP4在胶质淋巴系统中起到关键作用，该蛋白可能有助于胶质瘤的进展。然而目前几乎没有关于AQP4和神经胶质瘤免疫系统的研究，其在胶质瘤免疫微环境中的作用仍不明确。单细胞测序提供了新的研究角度去探索AQP4与胶质瘤免疫微环境之间的相关性。

思维导图





研究结果

1.胶质瘤样本的肿瘤细胞异质性
研究采集了公共数据集和6名胶质瘤患者的样本，经过质控和筛选，共保留53059个细胞。根据marker基因分为巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、少突胶质细胞和周细胞。通过inferCNV分析，鉴定了其他的细胞簇是恶性细胞，且这些细胞簇彼此分离，也表明其具有高度异质性。



图1 胶质瘤样本的单细胞测序大类分群与inferCNV结果

2.AQP4表达谱因胶质瘤样本而异
基于恶性细胞的降维图，进一步检查了每个胶质瘤样本中的AQP4表达。有趣的是，AQP4表达谱因胶质瘤样本而异。AQP4在4个样本(样本1、2、12、39)中的表达相对较高，在其他样本中较低。因此将样本1、2、12、39作为“高AQP4”组，其他的样本作为“低AQP4”组。



图2 恶性细胞的AQP4基因表达量

3.AQP4与胶质瘤预后的关系
为了证明AQP4表达多样性的意义，使用了TCGA公共数据集中肿瘤样本和配对的正常组织进行了比较。基因表达谱显示，AQP4在胶质瘤中比在正常脑组织中表达量高。在其他器官中，则无论肿瘤及配对正常组织，表达水平均非常低。进一步分析对比了胶质瘤不同亚型(低级别胶质瘤和胶质母细胞瘤)及正常脑组织之间的AQP4表达水平，发现AQP4在胶质瘤样本中均倾向于过表达，推测AQP4可能对胶质瘤的进展有影响。通过Kaplan-Meier生存分析来研究胶质瘤AQP4表达与预后之间的关联。与低AQP4组相比，高AQP4组在低级别胶质瘤中均具有较短的OS，而在胶质母细胞瘤中，两组之间的OS差异不明显。



图3 肿瘤样本和配对正常样本的AQP4表达谱



图4 生存预后分析

4.AQP4相关差异基因与胶质瘤免疫微环境相关
为了寻找更多与胶质瘤预后相关的marker，进一步筛选了AQP4相关的基因，最终在高AQP4组找到4个过表达基因，CD74、HES1、CALD1、HEBP2。
有研究表明，脑肿瘤利用CD74活化来逃避促炎M1巨噬细胞的转化，表明CD74与脑肿瘤免疫微环境密切相关。HSE1，受到NOTCH信号通路、Hedgehog及Wnt信号通路的调节，也与免疫反应有关。CALD1是一种细胞骨架相关蛋白，与肿瘤血管生成和胃癌免疫浸润有关。HEBP2基因与先天免疫相关。这些过表达基因都与免疫微环境相关。
对巨噬细胞按照两个分组分别进行Monocle3拟时间轨迹分析。观察到两组的差异基因的拟时间轨迹模式基本相同。在分析M1、M2极化相关巨噬细胞marker的表达量时，发现高AQP4组的巨噬细胞倾向于向M2巨噬细胞的方向极化，而低APQ4组的巨噬细胞则没有明显的倾向。本研究也进行了蛋白互作网络分析，也发现了上述四个差异基因及M2极化相关基因。



图5 AQP4相关差异基因表达水平



图6 拟时间轨迹分析揭示巨噬细胞的不同调节模式

5.AQP4表达水平与胶质瘤细胞状态的分布有关
接下来，将高AQP4组和低AQP4组的恶性细胞，分别进行monocle3拟时序分析。OLIG2基因是恶性胶质瘤的干细胞marker，选择其作为拟时序分析的根节点，发现上述4个差异基因在拟时间轨迹的起点(即具有增殖潜力的细胞中)几乎没有表达。
之前一项研究报告，胶质瘤恶性细胞包含四种不同的细胞状态，根据微环境的差异，这些状态是可塑的。基于此，根据Neftel等人报道的算法来标记四种不同的细胞状态：少突胶质细胞祖细胞样(OPC样)、神经祖细胞样(NPC样)、星形胶质细胞样(AC样)和间充质样细胞(MES样)。发现高AQP4组的恶性细胞倾向于MES样和AC样细胞，而低AQP4组的细胞则不是，表明AQP4表达水平可能与恶性细胞的状态比例有关。



图7 不同细胞状态评分

结论

AQP4是一种水通道蛋白，以前很少有研究将AQP4与胶质瘤免疫微环境联系在一起。作者利用单细胞测序技术对神经胶质瘤中的不同细胞类型进行了AQP4相关分析。发现AQP4可以提示与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的极化趋势，从而导致胶质瘤恶性细胞状态的改变。

参考文献

Wang R, Peng L, Xiao Y, et al. Single-cell RNA sequencing reveals changes in glioma-associated macrophage polarization and cellular states of malignant gliomas with high AQP4 expression[J]. Cancer Gene Therapy, 2023: 1-11.

供稿：市场支持中心
审核：市场支持中心

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程超

前排顶，很好！