单细胞如何研究肿瘤微环境？值得借鉴的思路

花下风流花落花死花无常

肿瘤免疫微环境包含T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、髓系细胞等多种肿瘤浸润的免疫细胞，这些免疫细胞一方面抑制、杀伤肿瘤细胞起着抗肿瘤免疫作用，另一方面又起着促进肿瘤发展及免疫逃逸作用。因此，在当前肿瘤研究中，肿瘤免疫微环境已成为重要的关注点。
然而，传统基因测序方法只能捕获组织样本中不同种类细胞内基因表达信息平均后的结果，使得分析不能有效识别和刻画肿瘤微环境中各个免疫细胞的种类及其所处状态，同时也可能掩盖了许多关键的信息。因此，近年来单细胞测序在肿瘤研究中越来越受到重视，这是由于单细胞具有更高的分辨率，有助于阐明肿瘤微环境免疫细胞对肿瘤细胞发生、发展、转移、耐药和免疫逃逸等分子作用机制，从而使实体瘤的临床诊治和预测变得更加准确。
生信人也一直在持续关注有关单细胞研究的文章，推出了多个单细胞相关的研究思路及角度。今天小编就再和大家分享一个值得学习的单细胞分析思路——单细胞与组织相结合：研究中如果将单细胞水平和组织水平的基因表达特征结合起来，通常能够起到互相补充互相验证的效果，不仅可以丰富我们的研究内容，还可以使生信结果更加可靠，使研究结论更有深度。
因此，在这里小编为大家介绍一篇今年4月刚发表在Journal of Advanced Research（IF:12.822）杂志上的关于卵巢癌（ovarian cancer ;OV）免疫与预后的文章，这是一篇比较典范的单细胞与组织测序数据整合分析的文章，文章从组织入手发现现象后转到单细胞解析后又切回组织分析，其中用到的都是比较基础的生信方法，简单易懂，而且用到的也都是公共数据，但最终却发到了12+，可见组织与单细胞整合可谓双剑合璧，常常起到一加一大于二的效果。长话短说，接下来就让小编和大家分享下这篇文章的主要内容，一睹为快吧。

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Integrated immunogenomic analysis of single-cell and bulk tissue transcriptome profiling unravels a macrophage activation paradigm associated with immunologically and clinically distinct behaviors in ovarian cancer
整合单细胞和组织转录组的免疫基因组分析揭示卵巢癌中与免疫和临床差异行为相关的巨噬细胞激活模式

一． 研究背景
卵巢癌(OV)是妇科癌症相关死亡的最常见原因，具有高发病率和死亡率。其中大多数OV患者在诊断时已处于晚期。尽管OV患者可用手术和化疗等治疗方案，但多数患者仍会在化疗后复发，且OV复发患者的中位生存期常常低于2年，并且由于缺乏能够准确预测化疗应答的预测性生物标志物，其临床结局仍不尽人意。而目前越来越多的证据表明，巨噬细胞亚型的激活状态和不同谱系在肿瘤微环境中呈现动态异质性，在多种癌症类型中发挥着关键作用。因此，这篇文章就重点关注了不同亚型巨噬细胞的异质性、内稳态对卵巢癌生物学和临床结局等的影响。
二． 摘要
文章对单细胞和组织转录组进行了整合免疫基因组分析，系统地研究了巨噬细胞活化与预后和治疗疗效之间的关系。文章主要采用一致性聚类分析识别出了新的巨噬细胞亚型，并利用人工神经网络模拟巨噬细胞的动态激活。最终在泛队列中发现M0和M1巨噬细胞相对浸润丰度高与预后和疗效改善相关，而M2巨噬细胞则相反。研究也观察到无监督一致性聚类分析识别出的两个OV亚群具有不同的临床和免疫行为。最后，作者提出了一个巨噬细胞极化衍生的人工神经网络模型，其能够作为一个强大的预后因子和治疗疗效的预测生物标志物，该模型在不同的独立患者队列中都得到了验证。这篇文章刻画了巨噬细胞的异质性并解析了其与OV预后的关系，同时强调了巨噬细胞激活模型在预防和治疗肿瘤方面的临床潜力。
三． 数据及方法
1. 数据：作者从GEO、TCGA、ArrayExpress 数据库及PubMed发表的文献中获取了OV患者的肿瘤组织RNA-seq数据和临床信息。在排除无生存数据或化疗反应信息的队列后，该研究最终纳入了26个队列的2791个OV样本。同时研究从GEO数据库获得了5个独立的OV标本的167690个细胞的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据和临床信息，这五个样本中两个是化疗耐药患者，一个是化疗难治性患者，其余两个是化疗敏感患者。此外，研究也收集了一些发表文献的肿瘤组织RNA-seq数据和患者接受免疫阻断治疗的临床信息。
2. 数据处理和质控：作者使用Robust Multiarray Average算法对Affymetrix HG-U133A和HGU133_Plus_2平台的原始芯片数据进行标准化，其他平台的处理和标准化数据由相应作者或数据库提供。研究中scRNA-seq数据使用R包Seurat 进行质量控制和下游分析，利用其中的整合函数将5个样本整合到一个Seurat对象中。质控过程中排除表达基因小于200个、独特分子标识符(UMIs) 大于20,000和线粒体来源UMI计数大于10%的低质量细胞。最终有43057个细胞用作下游分析。接着作者使用Seurat中的SCTransform函数进行标准处理。并使用包DoubletFinder识别和删除双重事件细胞，最终留下40218个细胞后续分析。
3. 推断肿瘤浸润免疫细胞丰度：作者为了评估免疫微环境中特异细胞成分的分布，利用CIBERSORT测定了22种免疫细胞类型的相对比例。为了避免多个队列之间的偏性，作者在每个队列中分别确定了22种免疫细胞类型的相对比例，然后汇集起来进行进一步分析。
4. 一致性聚类:文章采用基于Pearson相关系数的K-means聚类方法进行一致性聚类，使用R包ConsensusClusterPlus 执行基于欧氏距离度量的聚类方法。
5. 单样本基因集富集分析：作者从先前研究中获取免疫调节基因，并从Molecular Signatures Database数据库获取hallmark基因集。每个样本的免疫调节基因集或hallmark基因集的富集评分用 ssGSEA与GSVA进行计算。
6. 巨噬细胞极化衍生人工神经网络模型(MacroANN)的建立：神经网络是基于输入层、隐藏层和输出层的机器学习模型。它是一种广泛应用于高维数据回归分析和分类的方法。作者为了捕获和量化巨噬细胞亚型的浸润模式，使用nnet包将各亚型巨噬细胞的浸润丰度转化为前馈神经网络。然后，开发了一个机器学习模型MacroANN，能够使用一个基于神经网络的分类器区分UnPol和M2Pol功能状态。样本被随机分为训练队列和测试队列。作者预测了测试队列，并记录了预后及化疗应答的差异。该分类器也被应用于免疫治疗队列，以区分可能受益于治疗的患者和可能不受益于治疗的患者。

四． 主要内容及结果
1. 公开OV数据集的免疫基因组特征揭示了巨噬细胞在OV预后和化疗中的关键作用
在文章的第一部分，作者首先定量估计了肿瘤微环境（TME）中免疫浸润的细胞组成，并利用单因素Cox回归分析评估了18个公开的OV队列中每种免疫细胞类型的预后影响。然后利用18个OV队列进行meta分析，对每种免疫细胞类型进行总体预后评估。结果发现:naïve CD4 T细胞、静息CD4记忆T细胞、M2巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润与预后不良相关。而活化CD4记忆T细胞、M0巨噬细胞和M1巨噬细胞浸润与改善预后相关(图1A)。生存分析显示，naïve CD4 T细胞、静息记忆CD4 T细胞、M2巨噬细胞或嗜酸性粒细胞低浸润患者的OS明显高于高浸润患者，而活化CD4记忆T细胞、M0和M1型巨噬细胞低浸润患者的OS明显短于高浸润患者(图1B)。接下来，作者在11个有化疗信息的公开OV队列中进一步研究了每种免疫细胞类型与化疗应答之间的关系。结果发现化疗敏感组和化疗耐药组的9种免疫细胞浸润丰度有显著差异(图1C)。化疗敏感组的记忆B细胞、滤泡辅助T细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、活化树突状细胞明显富集。相比之下，化疗耐药患者naïve B细胞、静息NK细胞和静息CD4记忆T细胞的浸润丰度增加。为了进一步验证OV中巨噬细胞的临床意义，作者对17例OV患者(10例复发和7例不复发患者)进行了M1和M2巨噬细胞标记物CD86和CD206的免疫组化检测。结果如图1D所示，CD86在非复发患者组织中的表达水平显著高于复发患者，而CD206在非复发患者组织中的表达水平显著低于复发患者。这些结果表明，巨噬细胞与OV的预后和治疗效果有关。





图1 免疫浸润细胞组成与预后和化疗反应性的关系

2. 单细胞转录组分析证实了巨噬细胞的功能状态与化疗反应之间的联系
在文章的第二部分作者对5例OV患者的scRNA-seq数据进行分析。作者共分析了40218个细胞，其中31358个细胞来自化疗耐药患者，8860个单细胞来自敏感患者。作者在这些细胞中识别了四种免疫细胞类型，包括T或自然杀伤(NK)细胞、B细胞、髓样细胞和浆细胞样树突状细胞，以及四种非免疫细胞类型(图2A)。分析发现化疗耐药样本在成纤维细胞、髓样细胞和上皮细胞中高度富集，而B和T或NK细胞在化疗敏感样本中富集(图2B)。随后髓系细胞被进一步分为5个巨噬细胞亚群，2个髓系树突状细胞亚群和1个单核细胞亚群(图2C)。作者发现Macro-C1特异性表达趋化因子基因 CCL3、CCL4和CCL5，并显示M1和M2巨噬细胞标志物共表达(图2C和D)，而Macro-C3中FTL表达水平升高，Macro-C4高表达SPP1，Macro-C5则高表达M0巨噬细胞标志物。此外，Macro-C5表达高水平的促炎细胞因子和趋化因子(图2D)，表示M1表型极化。这些结果表明，Macro-C2、-C3和-C4对应M2样巨噬细胞，Macro-C5对应M1样巨噬细胞。此外，作者也观察到巨噬细胞亚群分布的差异，M2样巨噬细胞在化疗耐药患者中占主导，而来自化疗敏感患者的样本则富含Macro-C5(图2E)。随后作者对化疗耐药和化疗敏感样本的巨噬细胞亚群进行分级聚类和KEGG通路富集分析，发现具有不同的表达模式(图2F)。化疗耐药组的巨噬细胞亚群表达的基因涉及多种疾病相关通路(如脂质、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎等)。相比之下，来自化疗敏感组的巨噬细胞亚群在免疫和抗肿瘤相关通路(IL-17信号通路和TNF信号通路)中富集。因此，可见scRNA-seq分析支持了组织转录组的发现，并表明巨噬细胞的激活状态与化疗反应性相关。



图2 卵巢癌肿瘤内细胞类型异质性的单细胞RNA测序分析

3. 巨噬细胞的功能状态确定了临床不同的患者亚群
在文章的第三部分，作者探讨了不同亚型巨噬细胞的相对浸润丰度与患者预后的关系。根据M0、M1和M2巨噬细胞浸润丰度的中位值将2791个OV样本分为8类(图3A)。作者观察到8组间OS有显著差异。与其他组相比，M0hiM1hiM2lo组患者的OS更高(图3B)。此外，作者还分析了巨噬细胞浸润对总体应答的影响。结果显示，M0hiM1hiM2lo组患者的化疗应答率最高，而M0loM1loM2hi组患者的化疗应答率最低(图3C)。接下来，作者通过无监督一致性聚类分析，确定了两个具有不同功能状态的患者亚组(图3D)，其中组1（UnPol亚型）的特征是M0和M1巨噬细胞的丰度高，而组2（M2Pol）则显示M2巨噬细胞的丰度高和M0及M1巨噬细胞的丰度相对低。生存分析显示，UnPol亚型与OS改善相关（图3E)。作者还注意到，UnPol亚型与M2Pol亚型在化疗应答方面显著不同(图3F)。此外，作者也发现TCGA定义的分子亚型几乎可以平均分为UnPol和M2Pol亚型，这表明了这两种亚型的实用性(图3G)。此外，也发现这种以巨噬细胞为基础的亚型分类通过多变量Cox回归分析调整其他临床特征后仍与OS保持着显著的相关性(图3H)。综上所述，这些结果表明TME中的巨噬细胞极化显著影响OV患者的临床结局。



图3 卵巢癌巨噬细胞潜在亚型的识别

4. 巨噬细胞的功能状态在免疫上区分不同的亚群
在这一部分作者进一步探索了可能导致亚组免疫行为差异的巨噬细胞的功能状态。首先，作者从Vidotto等人的研究中获得了包括63个免疫调节基因的基因集，其中包括免疫激活因子和抑制因子，然后计算了ssGSEA评分来评估免疫激活或抑制程度。结果发现如图4A所示，M2Pol亚型比UnPol亚型表现出更高的免疫激活和免疫抑制，这表明两种亚型之间可能存在不同的促进肿瘤免疫逃逸的机制。此外，作者分析了免疫检查点分子的平均表达水平，发现M2Pol亚型比UnPol亚型表达更高(图4B)。同时观察到主要组织相容性复合体(MHC) I类和II类以及非经典的MHC分子(抗原呈递分子)在M2Pol亚型中也上调(图4B)。作者还分析了化疗耐药和敏感患者的单细胞转录组数据中MHC和免疫检查点分子的表达水平，结果观察到，与敏感患者相比，耐药患者巨噬细胞中MHC和免疫检查点分子的表达水平明显更高(图4C)。这些结果表明M2Pol亚型肿瘤表达免疫检查点分子逃避免疫监测。作者进一步检测UnPol和M2Pol亚组中促炎细胞因子和趋化因子的表达水平，发现促炎细胞因子优先表达于UnPol亚型，而抗炎细胞因子主要表达于M2Pol亚型(图4D)，且肿瘤中巨噬细胞的趋化因子在不同状态下表达不同(图4D)，同时M2Pol亚型中肿瘤抑制因子CCL14表达上调。相比之下，促炎趋化因子CXCL5和CXCL1在UnPol亚型中表达上调。接着作者比较了UnPol亚型和M2Pol亚型在TME中不同免疫细胞亚群的分布和相对丰度，结果如图4E所示，可以观察到免疫抑制细胞亚群在M2Pol中富集，提示免疫抑制细胞的增加可能有助于M2Pol亚型的免疫逃逸。为了进一步研究UnPol和M2Pol亚型肿瘤是否具有不同的生物学特征，作者计算了每个样本的hallmark基因集的ssGSEA得分，并识别了参与细胞周期、炎症、免疫反应和细胞代谢的差异表达基因模块(图4F)。结果发现UnPol亚型具有细胞周期通路高激活的特点，而M2Pol亚型具有较高的炎症或免疫反应。作者也观察到氧化磷酸化和糖酵解标志基因集分别在M2Pol亚型和UnPol亚型中富集。





图4 UnPol和M2Pol亚型的生物学和临床特点

5. MacroANN预测患者的预后和治疗效果
在文章的最后一部分，作者在训练队列中开发了巨噬细胞极化衍生的人工神经网络模型(简称MacroANN)，来预测临床结果和治疗疗效(图5A)。当应用于试验队列时，可以观察到MacroANN能够区分患者化疗受益(图5B)，且受益组患者的生存时间明显优于无受益组。接着作者为了进一步测试MacroANN是否为免疫治疗应答提供了额外的预测价值，作者将MacroANN应用于三个免疫治疗队列。结果发现该模型准确预测了临床疗效，并将患者分为疗效组和无效组。与无获益组相比，预期获益组患者的应答率更高，且在Van Allen、Hugo和Gide组中，受益组患者的缓解率均高于无获益组患者相应的缓解率(图5C)。此外，生存分析结果表明，预测的受益拟合组与OS改善显著相关(图5D)。这些结果表明，MacroANN可以预测临床结局，以及对化疗和免疫治疗的应答。



图5 MacroANN是治疗疗效的预后因子和预测生物标志物

到这里，这篇文章的主要内容就介绍完了。文章将单细胞与组织相结合，重点关注了卵巢癌中巨噬细胞对临床结局，化疗及免疫治疗的影响。文章收集了多个平台的数据，内容充实，方法简洁，逻辑清晰。小编读完感觉文章这种从组织数据入手探索免疫微环境，转到单细胞进行验证互补，最终回到组织指导分型及预测临床结局的思路是文章的一大亮点。无论是主要关注组织还是重点研究单细胞的小伙伴都可以借鉴一下这个思路，毕竟单细胞与组织相辅相成，能够帮助我们从多个维度更好的研究自己的课题。
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