瘤内微环境对预后和免疫治疗的影响

飘散的云

近年来，随着癌症基因组学和免疫学的发展，成功建立起了癌症治疗的两大支柱——靶向疗法和免疫疗法。PD-1/PD-L1免疫疗法（immunotherapy）是最成功的肿瘤免疫疗法之一，引领癌症治疗的变革！今天分享一篇2022年12月1日发表在Computational and Structural Biotechnology Journal（IF：6.155）的文章，这篇文章介绍了膀胱癌肿瘤内微环境的情况，并据此建立一个分类器，用于预测膀胱癌患者的预后及其对抗PD-L1免疫疗法的反应。


研究背景
膀胱癌被认为是全球十大最常见的恶性肿瘤之一。虽然这种疾病在早期阶段可以通过手术治愈，但对于转移性疾病的患者来说，几乎没有治疗方案，其五年总生存率仍为15％左右。越来越多的证据表明，肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的串扰在肿瘤细胞生长、侵袭和转移中起着关键作用。此外，微环境中的免疫细胞可以发挥抑制肿瘤或促进肿瘤的作用，这将导致不同的临床结果。
膀胱癌组织内的肿瘤浸润性免疫细胞早已被描述。CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的存在与肌层浸润性尿路上皮癌患者的改善结果相关，而免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）和巨噬细胞的丰度与生存结果差相关。以低Tregs、低CD68+/CD163+巨噬细胞和高CD4+T细胞为特征的肿瘤患者主要对卡介苗（BCG）治疗有良好的预后。此外，膀胱癌是除黑色素瘤外唯一的免疫治疗可带来生存优势的实体恶性肿瘤。美国食品和药物管理局（US FDA）批准的靶向PD-1或PD-L1的免疫治疗药物在转移性膀胱癌患者中表现出长时间的稳定效果。包括膀胱癌在内的许多肿瘤的免疫治疗效果与肿瘤免疫微环境、新抗原、拷贝数变异（CNVs）和肿瘤突变负担相关。
本研究旨在通过全面收集浸润性免疫细胞/免疫反应相关特征，然后探索膀胱癌免疫微环境与癌症基因型之间的相关性，建立一个新的分类指标-膀胱癌免疫预后指数(bladder cancer immune prognostic index, BCIPI)。

主要结果
建立和验证BCIPI signature
为了全面建立基于免疫成分的膀胱癌预后指数，作者手工检索并修改了162个肿瘤浸润的免疫signature。通过ssGSEA方法计算每个特征在个体中的NES值。然后采用单变量Cox回归分析来确定这些特征在四个膀胱癌队列中的预后作用。进行荟萃分析对162个免疫相关特征的总体预测估计。最后有33个P值≤0.05的免疫相关特征被纳入构建BCIPI。每位膀胱癌患者的BCIPI评分是由11个选定的免疫相关风险标志物的NES值相加，减去22个保护标志物的NES评分而计算出来的，并采用热图法显示33个免疫相关标志物在BCIPI-H和BCIPI-L亚组之间的分布（图1A-B）。在所有四个膀胱癌队列中，BCIPI是总生存期的一个风险因素（图1C-F），而综合的荟萃分析得到了更有说服力的结果（图 1G）。
为了进一步探讨BCIPI系统是否可以作为目前可用的分期系统的补充，作者采用了RMS时间比来比较不同BCIPI亚组中患者的总生存结果。四个数据集的RMS时间比从0.65到0.84不等（图2），在所有四个膀胱癌队列中，总体预测值都有明显提高。这些发现表明，新定义的BCIPI是一个有效的分类系统，不仅能反映膀胱局部的肿瘤免疫浸润状态，预测膀胱癌患者的总生存期，还能为现有的分期系统增加预后价值。



图1. 基于免疫相关特征的33个指标可预测膀胱癌患者的总生存期



图2. 膀胱癌免疫预后指数(BCIPI)和整合标签之间的限制平均生存(RMS)差异

BCIPI-H和BCIPI-L亚组之间肿瘤浸润免疫细胞的比较
在TCGA-BLCA队列中，作者进行了GSEA来比较BCIPI-H组和BCIPI-L组的通路水平。结果发现两个亚组之间的差异显著集中在免疫相关的通路上（图 3A）。为了评估BCIPI是否反映了膀胱癌患者的肿瘤浸润免疫细胞/免疫反应，作者评估了BCIPI与Yoshihara等人定义的ImmuneScore和TumourPurity以及StromalScore之间的关联。结果显示，BCIPI与ImmuneScore和StromalScore呈明显的正相关，但与TumourPurity呈负相关。
作者还比较了四个膀胱癌队列中BCIPI-H组和BCIPI-L组的28个免疫细胞的浸润丰度。如图3B所示，四个队列中几乎所有的免疫细胞，如活化的B细胞、活化的CD4+T细胞、巨噬细胞、Th1细胞和Tregs，在BCIPI-H组比BCIPI-L组的丰度都高。作者选择CD163作为巨噬细胞的标记，结合CD163的IHC染色结果，发现在美国癌症联合委员会（AJCC）分期较低的膀胱癌患者中，CD163的高表达与不利的预后相关（图3C-D），而CD8+细胞的高比例则与有利的预后相关（图3E-F）。在PD-L1表达和膀胱癌患者的总生存期之间没有观察到明显的关联（图3G）。此外，Pearson相关测试也表明，CD8+细胞的百分比与总生存期有明显的关联（图3H）。结果表明，BCIPI可以反映膀胱癌患者的免疫状态，这也可能与化疗或免疫治疗反应有关。



图3. 膀胱癌免疫预后指数(BCIPI)高分组免疫细胞浸润高于BCIPI低分组

BCIPI-H亚组患者对抗PD-L1治疗呈正向反应
如上所述，肿瘤免疫状态可能与免疫治疗反应有关；因此，作者评估了BCIPI与66个免疫检查点的表达之间的相关性。值得注意的是，在所有四个膀胱癌队列中都发现了PD-L1和BCIPI之间的正相关，在这四个队列中，PD-L1的mRNA表达在BCIPI-H亚组中高于BCIPI-L亚组（图4A；图4C；图4E；图4g）。随后，作者评估了这四个膀胱癌队列中BCIPI亚组与抗PD-L1治疗反应之间的关联，结果表明，BCIPI-H亚组的患者可能比BCIPI-L亚组的患者更能从抗PD-L1治疗中获益（图4B；图4D；图4F；图4H）。



图4. 膀胱癌免疫预后指数(BCIPI)与抗PD-L1免疫治疗的疗效相关。

膀胱癌的基因组改变与BCIPI亚群的相关性
不同人群携带不同的基因突变，基因突变可能在肿瘤遗传和未来发展中发挥重要作用。BCIPI-L组和BCIPI-H组之间存在明显的突变差异。KDM6A（33 % vs 19 %）、FGFR3（23 % vs 4 %）、GRIA4（7 % vs 1 %）、CASC5（8 % vs 1 %）、ARHGAP35（8 % vs 4 %）和SVEP1（7 % vs 3 %）在BCIPI-L组的突变率明显高于BCIPI-H组，而在TCGA-BLCA队列中，PHLDB2（2 % vs 7 %）、XIRP2（8 % vs 16 %）、INO80（3 % vs 6 %）、DSP（4 % vs 10 %）、CUL9（3 % vs 7 %）和AHNAK（7 % vs 12 %）在BCIPI-H组的突变率明显高于BCIPI-L组（图5A）。BCIPI-H组的患者在ArmDeletion水平上显示出较低的CNV水平（图5B），但在FocalAmp水平上显示出较高的CNV水平（图5C）。作者还发现改变亚组的患者比未改变亚组的患者表现出更好的总生存结果。对于这些突变的基因，作者重点关注FGFR3，其突变导致FGFR3的高表达（图5E）。通过分析BCIPI-H和BCIPI-L亚组之间该基因的复发性突变，发现FGFR3-S249C等位基因的突变率在BCIPI-L组高于BCIPI-H组（12.74 % vs 2.96 %），其次是G370C（2.45 % vs 0 %），然后是Y373C（3.92 % vs 0 %）（图5F），表明这些复发性突变可能影响FGFR3的表达并随后影响肿瘤微环境。这些结果表明，FGFR3畸变可能与膀胱癌的肿瘤微环境有关。



图5. 膀胱癌免疫预后指数(BCIPI)高和低亚组之间的遗传差异

在外部队列中验证BCIPI，并与分子亚型进行比较
外部队列GSE32548、GSE48075和E-MTAB-4321被用来验证BCIPI的预后价值。GSE32548队列包含91个非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）病例和39个肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）病例；GSE48075包含一个NMIBC病例和62个MIBC病例；这两个队列记录了OS信息。E-MTAB-4321队列包含476例NMIBC患者，记录了现有的进展信息。在计算BCIPI评分后，观察到BCIPI在GSE32548（图6A）、GSE48075（图6B）和E-MTAB-4321（图6C）队列中呈现出很好的预测价值。
此外，作者还将BCIPI风险亚组与几个已知的分子分类法进行了比较。TCGA小组提出了一个新的膀胱癌分子分类系统，包括五个分子亚型（腔内型、腔内-乳头状/浸润型、基底型/鳞状型和神经元型）；作者发现BCIPI-H组的患者主要归属于基底鳞状型和腔内-浸润型亚型，而BCIPI-L组的患者则被映射到腔内-乳头状和腔内亚型（图6D），这与生存分析结果一致，表明基底鳞状和管状浸润亚型的患者比管状-乳头状和管状亚型的患者的预后更不利（图6D）。Kamoun等人报道了一个共识的膀胱癌分子亚型，在TCGA-BLCA队列中将BCIPI与之进行了比较。结果发现，BCIPI-H型患者占了Ba/Sq型和富含基质型的大部分，其预后也很差，而BCIPI-L型患者多来自预后良好的LumP型（图6E）。一个不寻常的情况是，虽然NE样亚型的预后最差，但在作者的分组中却被归为BCIPI-L，这反映出NE样亚型的预后与免疫途径的激活无关。对于NMIBC，Hedegaard等根据E-MTAB-4321队列证明了分子亚型，包括基底样、CIS样和管状亚型，其中CIS样亚型的进展生存期最差，管状亚型的临床结果最有利。作者比较了BCIPI与Hedegaard亚型，观察到BCIPI-H与CIS样亚型相似，而BCIPI-L主要由腔镜和基底样亚型组成（图6F）。



图6. 在外部队列中验证膀胱癌免疫预后指数（BCIPI），并与提议的分子亚型进行比较

总结
BCIPI与肿瘤浸润免疫细胞/免疫反应、总生存结果和抗PD-L1免疫疗法的相关性表明，该指数是膀胱癌的一个强有力的分类系统。BCIPI-H亚组的患者与不利的预后有关，但推测抗PD-L1免疫疗法的治疗效果更好。这些发现将帮助临床医生促进膀胱癌患者的个性化治疗。
参考文献
Bian Z, Chen J, Liu C, Ge Q, Zhang M, Meng J, Liang C. Landscape of the intratumroal microenvironment in bladder cancer: Implications for prognosis and immunotherapy. Comput Struct Biotechnol J. 2022 Dec 1;21:74-85. doi: 10.1016/j.csbj.2022.11.052   
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