Nature | 如何探究肿瘤免疫逃逸形成机制

新东方怡红院

免疫逃逸一直是肿瘤研究领域的热门话题，也是抗癌的难题。今天给大家介绍一篇2022年12月14日发表在nature上的文章，从多个角度深入探究卵巢癌的免疫逃逸机制。题目为：Ovarian cancer mutational processes drive site-specific immune evasion.
摘要
背景及方法：高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是一种典型的基因组不稳定的癌症，具有不同的突变过程、肿瘤异质性和腹腔内扩散等特点。免疫疗法对HGSOC的疗效有限，这突出了一个尚未得到满足的需求，即评估突变过程和肿瘤病灶的解剖部位是如何决定肿瘤微环境的免疫状态的。在这里，作者对42例未接受治疗的HGSOC患者的160个肿瘤位点进行了全基因组测序、单细胞RNA测序、数字组织病理学和多路免疫荧光的综合分析。
主要结果：同源重组缺陷型HRD Dup（BRCA1突变样）和HRD Del（BRCA2突变样）肿瘤含有炎症信号和持续的免疫编辑，反映出HLA多样性的丧失和高分化功能失调CD8+T细胞的肿瘤浸润。相比之下，携带折叠后反转的肿瘤表现出较高的免疫抑制TGFβ信号和免疫排斥，主要是幼稚/干细胞样和记忆T细胞。表型状态关联是特定于解剖部位的，突出了附件肿瘤和远端腹膜粘膜灶之间的组成、拓扑和功能差异。
该研究结果表明，解剖部位和突变过程是HGSOC进化表型差异和免疫抗性机制的决定因素。该研究提供了一个多组学细胞表型数据基础，从中开发和解释未来的个性化免疫治疗方法和早期检测研究。
接下来，我们详细看一下作者的整体研究吧。
背景前言
高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的主要定义特征是拷贝数改变和基因组重排形式的深刻结构变异，这是在几乎普遍存在的TP53突变的遗传背景下产生的。在大约一半的HGSOC病例中，同源重组（HR）修复途径基因如BRCA1和BRCA2的体细胞和种系改变导致HR缺陷（HRD）。
除了基因改变，患者通过内源性突变过程进行分层，从全基因组测序（WGS）的结构突变模式推断，包括HRD亚型（BRCA1相关串联重复，HRD-Dup；BRCA2相关间质缺失，HRD-Del），CCNE1扩增相关折叠倒置（FBI）的肿瘤和携带cdk12相关串联重复器（TD）的肿瘤。
HGSOC提出了一个独特的临床挑战，导致广泛的腹腔内疾病的诊断。长潜伏期允许克隆多样化和肿瘤免疫相互作用在腹膜腔的异质性微环境中展开。这提出了一个关键问题，即潜在的突变过程和局部组织位点如何影响克隆选择、肿瘤微环境（TMEs）和免疫识别。
因此作者进行了一项前瞻性研究，从WGS中捕获突变过程，从单细胞RNA测序（scRNA-seq）和在多位点的HGSOC病例中，基于原位多路细胞成像的空间拓扑结构。我们的研究发现确定了不同的免疫刺激和免疫抑制机制，它们与疾病位点和突变过程共同分离，从而定义了HGSOC中免疫识别和逃逸的新决定因素。
结果
工作流程及患者信息
在24个月的时间内，从新诊断的、未接受治疗的患者中收集了多个部位的组织活检，这些患者正在接受腹腔镜手术或初级去瘤手术。采集的解剖部位包括附件（即潜在原发病变）、网膜、网膜、腹膜、肠、腹水和其他腹腔内部位（图1a）。所有患者的临床特征见图1b。
患者样本分析使用CD45+和CD45−流分类分数，苏木精和伊红（H&E）染色和多路免疫荧光（mpIF）固定组织切片，临床肿瘤正常MSK影响和全基因组肿瘤基因测序肿瘤正常测序（图1）。




扩展数据图1
位点特异性TME
根据scRNA-seq数据构建细胞类型图，量化了9种广泛的细胞谱系：上皮细胞、淋巴细胞（T和自然杀伤细胞（NK）细胞、B细胞、浆细胞）、骨髓细胞（单核/巨噬细胞、树突状细胞（DC）、肥大细胞）和基质细胞（成纤维细胞、内皮细胞）（图2b、d）。
卵巢癌细胞表现出较高的患者特异性（图2c），这归因于肿瘤细胞特异性体细胞拷贝数的改变驱动基因剂量效应。患者体内免疫细胞的组成不同（图2e、f）。CD45−组分（从富成纤维细胞到富癌细胞样本）在解剖部位之间大部分保守（图2g），而CD45+组分（从富髓系细胞到富淋巴细胞样本）有很大的差异（图2f、g）。不出所料，腹水样本富集T细胞和树突状细胞，而附件样本富集的T细胞、B细胞和树突状细胞相对减少。在实体肿瘤部位中，在肿瘤和基质区域的scRNA-seq、整个载玻片H&E和mpIF（图2g-i）中的非附件部位中发现了较高的淋巴细胞和CD8+T细胞分数。


图2
位点间成分变化引出更深入的分析，以评估免疫细胞表型状态。作者确定了10个主要的T和NK细胞集群与41个小子集群（图3a），广泛定义CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、先天的和γδT细胞、NK细胞和循环细胞。T和NK细胞簇遵循均匀流形近似和投影（UMAP）空间的梯度（图3b），突出了位点特异性的表型差异，这些差异通过拟合聚类组成的广义线性模型（GLM）来量化（图3c）。
特别是，在附件样本中，幼稚/干细胞样和中央记忆CD4+ T细胞被耗尽，而在腹水中富集。相反，功能失调的CD4+和CD8+ T细胞在腹水中耗尽，但在附件和其他肿瘤部位富集，这与实体肿瘤中慢性抗原暴露驱动的功能障碍一致。调节性T细胞和调节性NK细胞的簇也在附件样本中富集（图3c），这可能表明这些位点的免疫调节反馈增加。
患者实体肿瘤部位的比较显示，非附件部位的幼稚/干样和中央记忆T细胞富集，附件部位的功能失调的T细胞富集。附件样本中T细胞表型的位点内变异较高，表明患者体内和患者之间实体瘤和腹水的成分差异很大（图3d）。
分化轨迹沿着终末功能失调和干扰素刺激基因T细胞状态的两个轴投射CD8+T细胞（图3e），定义为幼稚T细胞标记物的丢失和附件和网膜的获取，功能失调和细胞毒性性状（图3f）。值得注意的是，不同部位的表达轨迹也不同，腹水表现出较高的细胞毒性模块分数，而附件和网膜中的T细胞功能失调分数较高。
髓系和DC隔室中的表型状态组成也随着部位的变化而变化。因此，淋巴细胞和髓细胞的表型免疫状态分化与肿瘤部位密切相关，这是TME患者内部和患者之间变异的基础，并提供了腹水免疫表型成分不代表实体瘤的明确证据。


图3
肿瘤细胞表型多样性
接下来，作者定义了癌细胞的突变过程如何影响癌细胞的内在信号传导和免疫表型。从CD45−细胞中鉴定出了10个上皮簇（图4a），包括具有升高的Janus激酶（JAK）-信号转导和转录激活物（STAT）、核因子（NF）-κB和肿瘤坏死因子（TNF）信号（Cancer.cell.3）、转化生长因子β（TGFβ）信号（Cancer.cell.4）和缺氧（Cancer.cell.6）的细胞（图4b）。突变特征特异性聚类富集包括HRD-Dup中的Cancer.cell.3和FBI中的Cancer.cell.6（图4c，d）。与FBI病例相比，在HRD-Dup病例的附件病变中，Cancer.cell.3中的所有三种免疫信号通路均显著增加（图4e）。相比之下，TGFβ信号在FBI病例的非附件部位更为显著。
值得注意的是，癌细胞簇因主要组织相容性复合体（MHC）编码基因的表达而不同（图4f）。MHC I类基因和MHC II类基因在Cancer.cell.3中高度表达（图4f）。虽然在样本水平上，Shannon熵在突变特征中显示出相似水平的细胞内在多样化，但FBI肿瘤在附件样本对中表现出更高的Bray-Curtis差异（图4g），潜在地表明这些癌细胞在迁移到远端位点时具有更大的表型多样性能力。


图4
此外，观察到原始T细胞和功能失调T细胞的明显组成差异是突变特征（图5a），FBI肿瘤中原始/干样和中央记忆T细胞簇和HRD肿瘤中功能失调的T细胞富集（图5b），这同样反映在HRD Dup肿瘤中较高的JAK-STAT信号（图5c）和T细胞表型的分化轨迹（图5d）。T细胞固有和癌细胞固有JAK-STAT信号在突变亚型的匹配样本中相关（图5e）。在HRD Dup肿瘤中发现了更高的表型T细胞状态多样性，伴随着患者内显著一致的Bray-Curtis指数，这表明多样化过程在患者之间反复发生（图5f）。
使用mpIF，测试了HRD肿瘤中增强的免疫信号是否可以归因于肿瘤中的癌细胞和免疫细胞之间的相互作用以及TME中的间质隔间（图5g）。与附件样本相比，活化CD8+PD-1+TOX− T细胞在非附件样本中更为普遍，HRD亚型中的差异比FBI病例中的差异更为明显（图5g），这意味着T细胞-抗原相互作用减少（图5g）。


图5
突变过程驱动免疫编辑
接下来研究了HRD亚型中免疫信号的增加是否导致介导免疫逃逸的机制。作者使用SIGNALS算法描述了通过单细胞水平上携带HLA I类和II类基因的染色体臂6p杂合性缺失（LOH）推断的HLA呈递机制的缺失。预测仅限于癌细胞（图6a），每个细胞B等位基因部分（BAF）被分类为平衡的，不平衡或LOH和来自位点匹配的WGS和MSK-IMPACT数据集的正交基因组验证。作者观察到明显的患者间异质性（图6b，c）。值得注意的是，47个样本中的5个样本的附件损伤中存在克隆性6p LOH（图6e），与主要位点的“早期”免疫进化选择一致。
HRD Dup亚型患者022和FBI亚型患者065进一步显示了6p LOH的患者特异性进化时间（图6f）。还观察到HRD Dup中6p LOH的功能后果，包括JAK–STAT信号的上调，这在肠样本中最为明显，以及功能失调的CD4+和CD8+T细胞的增加（图6g）。总之，HLA等位基因的LOH与JAK-STAT信号传导增强和T细胞功能障碍的关联表明，HRD Dup肿瘤中6p丢失的“早期”免疫介导的进化选择，与FBI肿瘤中6pLOH的进化“晚期”克隆扩增相反。


图6
微环境的空间拓扑
上述单细胞分析将免疫表型变异与突变特征和肿瘤部位联系起来。作者试图通过对主要免疫细胞类型（T细胞和巨噬细胞）及其功能标志物（PD-1、TOX、PD-L1）的原位mpIF分析，通过肿瘤-免疫细胞相互作用和空间拓扑来验证这些发现。
突变特征也影响细胞相互作用，正如从scRNA-seq数据得出的髓系簇中PD-L1（CD274）和HRD亚型中T和NK细胞簇中PD-1（PDCD1）的更高受体-配体共表达所预测的。细胞邻域的空间组织也因突变亚型而异，这反映在T细胞和panCK+PD-L1+癌细胞之间的最近邻距离上（图7a）。当结合位点和特征时，在HRD Dup附件和肠样本中观察到最短的中值距离，特别是在激活/功能失调和功能失调的T细胞室中（图7b），支持PD-L1作为HRD肿瘤中激活T细胞的负反馈机制。总体而言，mpIF分析进一步强调了位点和突变特征依赖性TME，与基于scRNA-seq的观察结果一致。


图7
小结
整体来说，该研究结果综合了解剖位点和突变过程，作为HGSOC TMEs及其表型状态的决定因素。虽然附件部位免疫细胞的相对缺乏是由卵巢和输卵管的免疫特权驱动的，但这些部位功能失调的T细胞占优势反映了癌症发展早期的免疫反应性及转移部位的免疫逃逸。此外，特定的转移部位可能存在组织特异性的免疫监测限制。TME内和TME间的高度异质性强调了免疫抵抗机制在特定患者中并不是普遍的，需要解释单个肿瘤中免疫反应的进化。
总之，该研究提供了广泛的多模态资源，绘制了HGSOC TMEs的细胞成分，并将它们与突变过程和空间环境联系起来。结果表明即使是个性化的治疗方法也可能对患者体内广泛的异质性疾病无效，这突出了在扩散到腹膜腔之前迫切需要早期发现。
关注相关生信分析思路的小伙伴，可以直接联系生信人
更多热点文章