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刘博谈 | 聊一聊传染病分子测定在诊断测试方面的应用

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发表于 2023-1-7 19:33:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

大家好,我是刘博,从今天开始呢,我来和大家聊一聊传染病分子测定的开发。先要和大家说明一下,咱们呢,讲的是开发的思路,也就是定义怎么明确、要怎么切入,有哪些方面需要考虑等等,但并不涉及技术方面的具体讨论。当然,我们在谈论开发的时候,肯定会涉及一些技术方面的东西,但会以介绍为主。
行,闲话少说,咱们这就开工。
自从新冠疫情爆发以来,传染病分子诊断已经被大家所熟知,也就是在1个月前我们还在做的全民核酸检测,从这个方面我们就可以发现传染病分子诊断的预期用途,那就是用于检测特定的或广泛的病原体(例如,综合症检测组合),评估新出现的传染病原体,监测,早期检测生物威胁因素,以及剖析抗菌素和抗病毒的抗性。
随着测定灵敏度和特异性的提高,多重检测能力的越来越强大,以及大规模应用推广之后带来的成本下降,传染病分子测定在这些方面的用途是越来越广泛。
注:其实这些方面在新冠分子检测的发展过程当中大家都看的到,比如,20年新冠刚刚出现的时候,新冠分子测定还只是用于诊断,后来为了实现大规模筛查的需求,灵敏度是有上升的,当然,现在如果开发一个家用的新冠分子测定,是可以考虑将灵敏度下调一些。当然,成本就更不用说了,从新冠刚出现的时候,一人份出厂价是100多,但现在一人份试剂终端价4块钱,而且还有厂家开始打整体价格战了,规模优势带来的成本下降非常明显。
所以,无论我们开发的试剂盒是作为IVD又或者是LDT使用(目前在国内,基本没有这方面的LDT),对临床实验室而言,这都意味着他们需要面对一项独特的责任和挑战,也就是如何理解分子测定、适当的使用它们、并正确的向临床医生传达分子测定结果的必要信息。
注:这一点实际上在新冠上也表现的淋漓尽致,就是关于是否还有传染性的问题,在《新型冠状病毒肺炎防控方案(第九版)》中认为CT值≥35就不具备传染性了,但这个其实很有问题,倒不是说这项研究本身如何,而是因为目前市面上所有的新冠分子试剂盒都是定性试剂盒,所以大家在阴阳性附近检测结果可以保持一致,但在其他的地方,就不一定了,而且在不同地点的设备、人员都不同,是否能精确复现35这个值都是很大的问题。用CT值来代表病毒载量,从而判断是否有传染性,本身就并不是一件靠谱的事情,所以从这一点上,我们也可以看到当时动态清零的困境:精准防控的实现难度非常大。
一般来说,我们可以将传染病诊断测试分为三个类别:筛查测试、诊断测试和确认测试,这三个类别彼此之间是有交叉重叠的。在临床上,这三种类别的测试都可以用于识别被感染的患者,从而达到治疗和管理的目的。同样的测试类型也可用于使用非临床样品(即食品、水和环境来源)的监测和监控,以及用于兽医和农业。
注:兽医并不是个小市场,比如,宠物传染病检测。
分子测定可单独使用,也可以和其他实验室测试联用,整合到诊断的算法当中(如反射性测试),从而用于诊断、预后、监测、筛查或风险评估当中。当然,我们也可以将分子测定在多个方面联用,从而进行一个纵向的诊断研究。
在本文当中,我们来讨论一下分子测定在诊断测试方面的用途。
现在,随着越来越多的病原体被测序和编目,许多生物可以用分子方法进行检测和鉴定。但是如何决定要使用哪一种分子测定呢?这就必须基于这项分子测定能带来什么样的临床价值。
在早期,分子测定被用于鉴定那些不容易培养、需要长时间培养或由于技术原因(如标本运输要求、周转时间长、技术要求高的程序)不容易恢复的生物。而且,由于分子测定具有更快的周转时间、多重检测能力强、可以实现自动化从而降低对人工的需求,这些发展增加了分子测定在临床应用上的优势,从而使得它在患者分流、感染对照和更快速做出治疗决定方面取得了一席之地,新冠分子测定就是一次最好的演出。
但是,这并不代表分子测定就是一个‘完美’的诊断技术,它也存在很多的局限性,比如因污染或交叉反应造成的假阳性结果,以及因抑制和不适当标本处理造成的假阴性结果。
此外,现有的测定平台可能无法同时识别多个物种/变种、毒力决定因素和耐药性,因此有必要在使用分子方法的同时继续使用传统的培养回收方法[1]。
分析灵敏度
虽然经过了新冠的洗礼,但是很多临床医生可能对分子测定工作知识还是很有限,因此会抱有一些不切实际的期望(比如上面谈到的Ct值35的问题),而且会认为分子诊断测试是非常灵敏的,比其他诊断测试方法具有更高的阴性预测值(这在新冠爆发初期的时候是一个非常明显的例子,大量无症状患者的核酸漏检)。
但实际上,除非所收集的标本中有足够数量的生物,否则每个反应(如20 μL)中只含有一个拷贝的分析检测限没有什么意义,例如,如果我们计划检测血液中的病原体,但是5至10 mL的全血中可能只有不到10至100个微生物。那么,为了可靠地检测和鉴定这类微生物,就需要从较大的样本量中提取和纯化核酸。
标本处理的其他问题包括:

  • 标本的抑制剂;
  • 含有核酸目标的细胞裂解不完全;
  • 提取后核酸回收效率低下;
  • 测试反应中使用的样品量小;
  • 核酸降解。
为了解决这些问题,就需要和培养方法一样,对不同的标本类型进行测试,或对不同日期采集的标本进行测试,这样才能非常有把握的地排除患者被感染的可能性。
所以,就算我们所使用的分子测定具有非常高的分析灵敏度,我们依旧需要进行严格的质量控制和采用经过验证的提取程序,这样才能保证我们获得最好的检测结果,从而得出正确的诊断结论。
分析特异性
外源污染导致的假阳性结果一直是核酸扩增方法的一个主要缺点,而引入大批量测试也增加了扩增子和标本的携带污染的风险。
检测系统中的非特异性信号也可能是假阳性的一个来源。有的时候,我们会非常固执的认为,我们检测的对象是基因片段,怎么可能会被一些无机物影响,造成假阳性结果呢?但实际上,这是有可能发生的,但这种固执的认为会蒙蔽我们的双眼,这样在对问题排查的时候会进一步的混淆方法特异性。
所以,我们对于实验室操作的要求要尽可能的细致,而对测定参数也要进行仔细的鉴定和验证,这样才能提高分子测定的特异性,让我们对阳性检测结果充满信心!
参考文献

  • Yang S, Rothman RE. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infect Dis. 2004;4:337-348.
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