5+纯生信，基于肿瘤微环境的分型值得您借鉴！

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导语

亲爱的生信科研人，你们好！今天给大家带来的是有关肿瘤分型的文章。不同的肿瘤分型有不同的治疗策略，目前肿瘤分子分型热点方向有焦亡分型、缺氧分型、铁死亡分型、免疫分型等等。其实，各种方向皆可分型，主要取决于你的分型能解决什么临床问题，比如能预测免疫治疗或者其他治疗的疗效，而且需要得到良好的验证。接下来，让我们一起聚焦于“Distinct tumor microenvironment landscapes of rectal cancer for prognosis and prediction of immunotherapy response”这篇发表于Cellular Oncology，影响因子为7.051的基于肿瘤微环境分型的研究，看看作者是如何对肿瘤微环境进行分型的，对我们有何借鉴意义。
背景介绍

肿瘤与环境，两者既是相互依存，相互促进，又是相互拮抗，相互斗争的。它是现代肿瘤生物学的一个关键和核心的问题。近年来由于肿瘤细胞学和分子生物学的进展，人们对于肿瘤和环境的相互关系有了更加深入的了解。这不仅对于认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义，而且对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用。
肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系，它不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的（核和胞质）内在环境有关。
肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)影响直肠癌（RC）的进展，其免疫因子的临床相关性已被广泛报道。在这里，我们旨在描述完整的TME景观，包括非免疫特征，以提高我们对直肠癌异质性的理解，并为精准医疗提供更好的策略。

研究思路

(1)使用Seurat和Cellcall对结直肠癌（CRC）GSE161277进行单细胞分析，以确定细胞与细胞之间的相互作用。
(2)采用ssGSEA对TCGA患者的TME元素进行量化，并进一步通过hclust将其聚类为亚型。
(3)结合WGCNA和LASSO构建了预后特征。
(4)在两个GEO数据集上验证了其性能。(图1A)
研究结果


1.TME细胞之间的相互作用
首先使用单细胞数据将样本分成16个不同的簇，热图显示每个细胞簇的前3个特征基因，通过SingleR包把细胞分为6个不同的类别；然后受体-配体-转录因子相互作用的预测表明每个细胞类别之间普遍存在细胞相互作用，特别是对于受体与其他细胞的配体进行细胞通讯的上皮细胞。最后研究了上皮细胞和其他细胞之间的相互作用影响肿瘤进展。例如T细胞-上皮细胞相互作用影响铂类耐药性和PD1-PDL1相关途径（图1B-D）。



2.基于TME的直肠癌分子亚型及不同TME亚型的分子特征
从已有得研究中获取TME成分得signature。代表TME中不同细胞类型的主要生物标志物包括19种免疫相关成分，9种非免疫基质细胞和7种上皮细胞。使用ssGSEA算法，根据其特征生物标志物的表达注释每个TCGA-READ患者中TME成分的丰度。发现肌成纤维细胞、杯状细胞、杯状祖细胞和潘氏细胞的浸润水平与RC患者的总体生存状态相关。基于ssGSEA的分层聚类将患者分为4个亚组（图2A），亚组1（免疫）表现出最高的免疫和非免疫基质细胞丰度，亚组2（典型）表现出中等免疫和非免疫基质细胞水平。亚组3和亚组4保留的免疫细胞数量最少，与亚组3（休眠）对比，亚组4（干细胞样）表现出较低的非免疫基质细胞丰度和较高的癌症干细胞和杯状细胞水平。在Pearson相关性分析中，Paneth细胞与巨噬细胞和许多其他免疫细胞的浸润密切相关，肌成纤维细胞、干细胞、血管内皮细胞、血小板、间充质细胞、成纤维细胞和周细胞呈正相关（图2B），表明基质细胞浸润可能与细胞干性有关。应用tSNE分析进行降维（图2C），获得了与分层聚类分析（图2A）相似的结果。用ESTIMATE对不同亚组的患者进行微环境相关评分：免疫亚组表现出最高得分，而干细胞样亚组表现出最低分（图2D）。不同TME亚型的患者表现出不同的生存曲线，免疫亚组在前两年的预后最差，而干细胞样亚组在三年后表现出更多不良结果（图2E）。
突变数据显示，不同TME亚型具有相似的最常见突变基因列表，即APC和TP53，最常见的突变类别是错义突变（图2F）。HLA蛋白，免疫相关刺激物，免疫相关抑制剂和微环境分子的水平在不同亚组之间有所不同（图2G-H）。TCIA的结果显示四个亚组的患者表现出不同的免疫反应预测，包括抗PD1，抗CTLA4和两者的组合（图2I）。



3.基于WGCNA-LASSO的退化TME子分型方法的构建
通过WGCNA分析将DEG划分为不同的模块，患者主要分为5个模块。不同模块与不同微环境因素和临床特征相关。作者对预后基因进行了皮尔逊相关性分析。相关评分高于0.5的基因通过Cytoscape软件可视化。其他GO和KEGG分析显示，不同组的患者具有不同的免疫细胞粘附，细胞外组织，稳态和免疫相关信号通路的富集状态。基于这些结果，选择的基因表现出不同的微环境状态和高正交性。最后，选择19个基因进行套索回归，属于5个不同的模块（MRAP，PLUNC：黄色模块; IL7R、DEGS1、BCL6、DHRS11 和 FAM129A：蓝色模块; KIF13A、ADAMTSL4、TIMP1、PDGFRA和FNBP1：绿松石模块; WNT5A、RRAGD、MYL9、ACTG2 和 HCP5：棕色模块; EDIL3 和 CFL2：灰色模块）。然后生成10个标记基因，将每个患者的风险评分确定为每个基因的总和乘以相应的系数（图3A-G）。



4.基于风险评分的高低风险组患者生存研究
TCGA队列中的患者按中位风险评分分为高风险组和低风险组。高风险组患者的总生存率低于低风险组。1年和3年生存率的AUC验证了签名的准确性，分别为0.848和0.948。校准曲线显示，实际生存状态与预测非常相似。采用不同的机器学习算法来预测5年的生存状态。为避免过度拟合，随机选择一半样本作为训练集，并使用整个样本作为测试组。与所有算法集成的10基因在预测5年总生存状态方面是稳健的。该特征还预测了RC患者的DFS和PFS。其他临床因素如年龄、阳性淋巴结状态和远处转移也与预后相关。通过整合所有风险因素发现10基因特征评分是RC患者预后的独立因素（图4A-I）。



5.通过GSE17537和GSE161158验证TME signature
使用两个GEO数据集进行验证。根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。GSE17537结果显示，高危组患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）比低风险组更差。通过1年、3年和5年的AUC验证了signature的准确性，在OS和DFS中均表现出良好的预后性能。校准曲线进一步表明，实际预后结果与预测结果吻合良好。在GSE161158中，高风险组患者的DFS也比低风险组更差。该模型的1 年、3 年和 5 年 AUC 值分别为 0.641、0.680和 0.657。校准曲线显示实际预后结果与预测吻合良好。GSE161158中风险评分升高的患者与晚期肿瘤分期密切相关，表明这种特征与肿瘤进展相关。作者还通过将其与其他临床因素相结合，验证了这种10基因标记作为独立的预后因素（图5A-L）。



6.TME标志的特点及其临床应用
风险评分增加的患者与晚期肿瘤分期、肿瘤大小增长和淋巴结转移相关。利用GSEA来揭示该特征的生物学特征。高危组主要富集RNA定位和mRNA转运，低风险组在代谢过程、抗原加工和内源性抗原呈递方面相对富集。与TME分类相比，高风险组患者与免疫组和Stem样组匹配更紧密，而低风险患者与规范组和休眠组匹配更紧密，低风险患者与POLE和GS类别更匹配。TCIA的预测表明抗PD1免疫疗法对低风险组的效果更好。风险评分较高的患者不仅在两个数据集中表现出较差的预后，而且对抗PDL1和抗PD1治疗的反应也较差。因此，作者建议将这种10基因组合作为基于免疫检查点的免疫疗法的有效预测工具，特别是对于PD1 / PDL1阻断（图6A-L）。
此外，作者发现化疗药物（例如伊马替尼和索拉非尼）的有效性也可以通过签名来预测。低风险组的患者对这些化疗药物表现出较低的IC50值对突变谱的分析显示最常见的突变基因列表在很大程度上由两个亚组共享。与低风险组相比，高风险组的总体突变率相对较低（图6M-R）。



在签名中的10个基因中，DEGS1和RRAGD在高危组中上调。这两个基因的上调与较高的风险程度相关。DEGS1 / RRAGD过表达与肿瘤分期和肿瘤大小之间存在很强的相关性。在I期肿瘤中观察到RRAGD的下调，与此一致的是，T4中的RRAGD表达明显高于T1-3。TIMER分析显示，DEGS1与CD8T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润相关；RRAGD表达与CD4T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞的浸润相关（图7A-J）。



在大多数亚群中高危组的存活率比低风险组更差。作者将该特征与年龄和M分期相结合，构建诺姆图来预测RC患者的生存期。ROC曲线显示1年，3年和5年的AUC分别为0.875，0.957和1.000。从校准曲线推断出患者的实际生存期，与预先建立的列线图预测相似（图8A-O）。



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