Cell最前沿：肿瘤也是活真菌“培养基”？

午夜咖啡

一、肿瘤微生物研究导读
癌症是全球死亡的主要原因之一。宿主-微生物免疫相互作用深刻影响肿瘤的发生、癌症进展和对治疗的反应。微生物组最近因其对癌症表型的影响而受到越来越多的关注。越来越多的证据表明，人类微生物组与癌症和癌症预后有关，包括病毒、细菌和真菌。一些细菌种类与癌症的发展和进展有关，例如幽门螺杆菌与胃癌的发生高度关联。这些与癌症相关的细菌的共同之处是它们具有调节宿主免疫和引发慢性炎症的能力，这些特征被认为有助于它们的致瘤能力。2020年Nature的研究工作表明，细菌DNA在癌症患者的血液中循环，可能作为一种肿瘤生物标志物，而肿瘤细胞内细菌已在多种肿瘤类型中被发现。
然而，真菌在这些过程中的作用在很大程度上仍未被探索，真菌微生物群和癌症之间的决定性联系仍然难以捉摸。真菌和细菌共同定植于哺乳动物的胃肠道、皮肤上皮、呼吸道和生殖器官，形成了微生物-微生物和宿主-微生物相互作用的复杂生态系统，对人类健康具有重大影响。尽管真菌只占肠道微生物DNA的0.1%，但是真菌感染造成全球每年150多万人死亡。
2022年9月，在《Cell》杂志上同时发表了两项最新研究A pan-cancer mycobiome analysis reveals fungal involvement in gastrointestinal and lung tumors和Pan-cancer analyses reveal cancer-type-specific fungal ecologies and bacteriome interactions，发现真菌的流行与癌症之间存在很强的相关性，提示了真菌作为肿瘤biomarker的潜在价值。2022年10月，在《Nucleic Acids Research》上发表了两篇关于肿瘤微生物相关的数据库microbioTA和BIC（详情见文末）。肿瘤微生物已经成为一个新的热点研究方向！

二、2022 Cell重磅研究：TCGA泛癌真菌组分析揭示真菌参与胃肠道和肺部肿瘤
作者使用宏基因组的分析策略对TCGA肿瘤样本的WGS数据进行分析，癌症类型包括HNSC，ESCA，STAD，COAD，READ，BRCA，LUSC，LGG。这种方法使我们能够在多种癌症患者组织类型中检测到真菌序列，真菌的检出率较高的是肺组织和胃肠道特定部位。因为大脑通常被认为是一个无菌器官（脑真菌感染通常是致命的），在脑组织中检测到很少的真菌序列，作者使用脑组织的微生物信号作为一个阴性对照，认为这些检测信号是假阳性的。
结果发现在头颈癌、肺癌、结直肠癌中有较多的真菌序列。正如预期的那样，与细菌DNA相比，真菌序列在组织中的微生物序列占比要小得多。对于真菌的类型，脑部肿瘤数据中基本上不存在白色念珠菌(C.albicans)和酿酒酵母(S. cerevisiae)的基因组序列，但在上消化道肿瘤中基因组比对率较高。在肺肿瘤中，与皮炎芽胞杆菌（B.dermatidis）的基因组比对率较高，但在其他肿瘤中未发现。球形分枝杆菌（M.globosa）在包括大脑在内的多个测序项目中显示出相似的深度，reads是随机分布的，这是生物污染的标志。



图1 在多种癌症类型中存在真菌的DNA序列

作者使用宏基因组分析的方法产生了物种水平分辨率的数据，允许在不同的肿瘤类型中鉴定特定的真菌。主坐标分析(PCoA)和对TCGA癌症类型的物种丰度进行的分层聚类表明，头颈部、结肠和直肠肿瘤具有高度相似的真菌组成，胃和食管肿瘤也是如此，而非胃肠道肿瘤的真菌组成在很大程度上不同，可能受到不同位点的pH、氧气浓度或细菌生物地理学的影响。
除了环境因素外，这些样本中真菌物种的检测还受到参考基因组可用性的影响，这意味着可能有其他未知的真菌物种未被分析检测到。与肿瘤相关的真菌群落的特征是Saccharomycetales酵母菌目的高丰度和高流行率，这与之前依赖于宏基因组学、依赖微生物培养的分析研究一致。与身体其他部位相比，假丝酵母在整个胃肠道中的丰度更高，这与它们在身体这一部位的已知共生状态以及疾病期间扩张的能力一致。有趣的是，作者在50例肺鳞癌患者中检测到6例芽生菌（Blastomyces）DNA。在一般人群中，芽生菌病的发病率为0~2例/10万。总之，这些发现表明，真菌DNA的存在与来自特定身体部位的组织之间存在有生物学意义的关联。



图2 原发肿瘤样本中存在疾病特异的真菌

为了探索真菌相互作用网络和共丰度类群的潜在存在，作者应用了SparCC算法，发现白色念珠菌（C. albicans）和酿酒酵母（S. cerevisiae）分别位于胃肠道癌症类型的两个相关共丰度簇的中心。



图3 跨界分析揭示了念珠菌和酵母菌相关的胃肠道癌症共丰度群

为了更好地理解念珠菌和酵母菌共丰度群对胃肠道癌症的影响，作者接下来试图比较胃肠道肿瘤中念珠菌和酵母菌的比例。在多种癌症类型中，作者发现念珠菌酵和母菌的比例显示出显著的双峰性，证实了之前观察到的念珠菌和酵母菌共丰簇，并提示胃肠道肿瘤可能具有双峰性，即可以被可靠地分为念珠菌相关癌症和酵母菌相关癌症亚组。为了了解这两个亚组的相关性，将胃肠道肿瘤分为念珠菌占优势(Ca型)和酵母菌占优势(Sa型)，并对它们的RNAseq数据进行比较。

有趣的是，IL22、IL24、CARD10和CD44在Ca型肿瘤中表达上调，而在Sa型肿瘤中无表达。基因集富集分析表明念珠菌的存在与细胞黏附分子相关。在胃癌中，作者发现与细胞因子相互作用、宿主免疫和炎症相关的基因在Ca类型肿瘤中正富集，包括IL1A、IL1B、IL6、IL8、CXCL1、CXCL2和IL17C。这一促炎免疫特征与之前的报道一致，白念珠菌引起肠道中IL-1B、中性粒细胞和Th17细胞浸润。此外，作者探索了真菌特征和肿瘤进展的关系，发现念珠菌与消化道癌晚期进展和转移性相关。



图4 念珠菌与晚期和转移性消化道癌相关

为了进一步研究念珠菌的作用，作者接下来分析了真菌在下消化道的分布。子囊菌（Ascomycota）更常见于升结肠，一项有针对性的物种水平分析确定，白色念珠菌可能驱动升结肠中子囊菌门(Ascomycota)的丰度。接下来，作者试图通过实验来验证下消化道癌组织中的念珠菌。
为此，作者从一份原始结直肠肿瘤样本中获得了3份原发结直肠肿瘤样本，其中1份样本被归类为念珠菌阳性(TCGA-AG-A002)，2份样本被归类为念珠菌阴性(TCGA-AG-4015，TCGA-AG-3885)。作者对这3个样本进行了独立的ITS测序，并证实了TCGA-AG-A002中念珠菌的丰度高，而念珠菌在TCGA-AG-4015和TCGA-AG-3885中的丰度要低得多。
作者进一步研究是否可以在TCGA的胃肠道肿瘤中检测到念珠菌或其他物种的RNA。通过比较WGS和RNA-seq分析的真菌序列丰度，发现念珠菌基因组DNA的比例与念珠菌RNA转录本的存在高度相关，表明这些念珠菌在胃肠道肿瘤中具有转录活性。相比之下，其他物种提示从这些物种获得的DNA和RNA不代表活真菌。总之，这些数据表明，有转录活性的活念珠菌存在于与胃肠道肿瘤相关的组织中，并且在下消化道肿瘤患者血液中检测到的真菌DNA可能源自肠道。



图5 具有转录活性的活念珠菌与胃肠道肿瘤相关

为了进一步评估特定真菌在不同癌症类型中的流行率，作者进行了靶向分析白色念珠菌、热带念珠菌和酿酒酵母。结果表明，白色念珠菌、热带念珠菌和酿酒酵母均为阳性，在胃肠道肿瘤中比在乳腺肿瘤或脑肿瘤中更常见，其丰度与早期胃癌、晚期结肠癌相关。



图6 念珠菌存在于胃肠道肿瘤中，其高丰度与早期胃癌相关

在观察到较高的念珠菌比例与胃肠道癌症中免疫/炎症基因的表达增加相关后，作者试图通过比较肿瘤样本和正常组织中念珠菌的丰度，进一步探索特定真菌和胃肠道癌症类型之间的关联。结果发现，与患者匹配的正常组织相比，念珠菌在胃肿瘤样本中显著且独特地富集。念珠菌在肿瘤样本中的富集及其对胃肠道癌症的预测能力使作者质疑念珠菌是否可以预测疾病结局。

利用来自TCGA的生存数据，作者发现肿瘤相关的热带假丝酵母DNA的高发生率与胃癌患者的生存率下降显著相关，表明肿瘤部位念珠菌DNA的存在可能代表胃肠道癌症的预后生物标志物。



图7 癌症相关的真菌菌群和临床结局凸显了念珠菌的预测价值

局限性讨论与思考
本文作者提出真菌与多种人类肿瘤类型有关，并且特定的真菌可以预测生存。虽然这些数据是基于来自不同种族和地域的TCGA队列的肿瘤样本，以及来自验证队列的样本，但仍应在其他数据集中研究本文中给出的与生存、转移和基因表达的关联。此外，虽然在胃肠道肿瘤和念珠菌属之间发现了许多有趣的关联，但本研究的范围无法阐明念珠菌是否促进了这些表型，还是因为这些表型而丰富了念珠菌。

同样，无法确定其他物种的因果关系与富集关系。本文的分析表明，在胃肠道癌症患者血液中检测到的真菌DNA可能来源于肠道。然而，这些发现应该经过实验验证，以排除血液样本污染的可能性。虽然本研究的范围无法确定发现的肿瘤相关真菌是肿瘤内的还是来自与这些组织相关的黏膜，但到目前为止本文的数据提示了后者的可能性。未来的工作可以更好地了解真菌组或特定的真菌物种在癌症发展和进展中的作用。

三、肿瘤微生物相关的数据库
microbioTA
microbioTA是一个来自人类和小鼠肿瘤组织的全面的微生物组数据库，由哈尔滨医科大学校长张学院士团队建设完成，收集了来自25个人类组织的302个GEO数据集和来自14个小鼠组织的115个数据集，并对这些原始测序数据进行了微生物组序列比对。作者在人类的16534个样本中发现了6468种微生物，在小家鼠的3973个样本中发现了6213种微生物。此外，作者还对肿瘤组织的菌群丰度进行了基础分析，并提取了肿瘤组织的特征微生物供参考。



图8 microbioTA 数据库

BIC：癌症中细菌转录景观的数据库
作者使用TCGA miRNA测序数据，评估了32种癌症中的细菌丰度。为了揭示与癌症有关的细菌，作者应用分析过程中未映射到人类基因组的reads序列与细菌参考基因组进行比对，并开发了BIC数据库，用于研究癌症中细菌的转录景观。

BIC提供与癌症相关的细菌信息，包括细菌的相对丰度、细菌多样性、与临床相关性的关联、细菌和人类基因的共表达网络，以及它们相关的基因本体。用户可以轻松下载结果图和表格，或下载细菌丰度矩阵进行进一步分析。总之，BIC可以提供与微生物群落相关的癌症微环境信息。



图9 BIC数据库

四、利用bulk测序数据分析微生物的流程与套路
微生物组领域最常用的测序是扩增子测序和宏基因组鸟枪法测序，目前体系已经较为成熟。如何在利用已有的肿瘤组织测序数据，例如RNA-seq或WGS产生的fastq文件，进行微生物的分析则是我们要讨论的重点。对原始fastq的分析可以分为以下几个步骤：

• fastq序列质控与去接头，常用软件trimmomatic；
  
• 去除宿主的序列污染，常用软件Kneaddata；
  
• 序列比对与物种注释，常用软件Kraken2、MetaPhlAn3；
  
• 功能注释，常用软件Humann3；
  

进行物种分类注释后，可进行后续分析，例如样本、物种、功能描述，物种组成整体差异和分组具体差异，功能组成整体差异和分组具体差异，环境因子与微生物组的关系。



图10 微生物分析常用套路

参考文献：
1.A pan-cancer mycobiome analysis reveals fungal involvement in gastrointestinal and lung tumors , 2022, Cell
2.BIC: a database for the transcriptional landscape of bacteria in cancer. Nucleic Acids Research, 2022
3.microbioTA: an atlas of the microbiome in multiple disease tissues of Homo sapiens and Mus musculus. Nucleic Acids Research, 2022
4. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein & Cell, 2020
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