肿瘤相关巨噬细胞、T细胞耗竭，老表型翻出新花样，还得看 ...

礼拜柒

撰写：学术矿姐 来源：小张聊科研平台的“ 课题指南针”公众号，微信公众号搜索“ 课题指南针”即可关注/扫描关注见文末
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最近花博看文献，发现肿瘤领域关于免疫方向的高水平论文特别多，尤其是抗原递呈细胞（APCs）相关的研究方向逐渐成为香饽饽。
抗原递呈细胞是能够诱发淋巴细胞发生免疫应答作用的细胞，主要分为专职抗原递呈细胞（单核吞噬细胞系统、 树突状细胞）和非专职抗原递呈细胞（包括血管内皮细胞、上皮细胞、间质细胞、皮肤成纤维细胞、活化的T细胞等），近几年APCs研究多集中于专职抗原递呈细胞，也就是单核吞噬细胞（包括巨噬细胞）和树突状细胞（DCs）。
肿瘤免疫方向（包括免疫逃逸）成为研究热点其实已经很多年了，为什么最近几年仍然热度不减，而且不断有新研究层出不穷呢？这还得从肿瘤的特征和多种免疫逃逸方式说起。
2022年最新发布的综述《肿瘤特征》（Hallmarks of Cancer: New Dimensions，PMID: 35022204）中提出了14种肿瘤的典型的特征，其中与免疫直接相关的就有两个：免疫逃逸和促肿瘤炎症。



说到免疫逃逸，大家最先映入脑海的一定是免疫检查点（IC）吧？没错，表达免疫检查点确实是肿瘤免疫逃逸的方式之一，且靶向IC的药物已经广泛用于各种肿瘤的治疗。此外，肿瘤免疫逃逸的方式还有：低免疫原性、表达自体抗原、抗原调变作用和诱导形成细胞外屏障。
其中，诱导形成细胞外屏障的方式是物理隔离的原理，即肿瘤细胞通过调控细胞外基质，使免疫细胞难以接近与其发生接触。低免疫原性指的是肿瘤表面不表达MHC配体、黏附分子和共刺激分子；表达自体抗原则是肿瘤细胞被APCs摄取和呈递的抗原不会激活T细胞。免疫调变作用是指抗体结合肿瘤表面抗原后，肿瘤会通过内吞作用降解相关抗原，使其在细胞表面降低表达。后三种方式与APCs的功能都有关。


Ken Murphy et al.《janeway's immunobiology(8th)》：Garland Scie
今天要介绍的这篇文献讲的就是“表达自体抗原”的肿瘤细胞如何影响专职抗原递呈细胞（肿瘤相关巨噬细胞，TAM）导致CD8+T细胞耗竭，实现免疫逃逸的故事，题为“Tumor-associated macrophages expressing the transcription factor IRF8 promote T cell exhaustion in cancer”发表在免疫学权威顶刊《Immunity》上。（IF=43.474）


（DOI: 10.1016/j.immuni.2022.10.002）
研究概要（太长不看版）
背景：
临床问题：肿瘤中无法由anti-PD-1/PD-L1治疗逆转的T细胞耗竭机制仍未完全阐明；
已知：APCs调控CTL活性，尤其是表达IRF8的DC1s（I类树突状细胞）。单核/巨噬细胞可通过代谢物、细胞因子、PD-L1共表达，与DCs竞争性递呈抗原改变CTL功能；
科学问题：单核/巨噬细胞具有异质性，TAMs如何触发肿瘤反应性CTL衰竭仍尚不清楚。
亮点：
表达IRF8的TAMs递呈肿瘤细胞抗原并驱动细胞毒性淋巴细胞（CTL）耗竭；
MafBiCreIrf8fl/flPyMT小鼠（单核细胞特异性敲除Irf8的乳腺癌小鼠模型）缺失TAM抗原递呈，获得抗肿瘤CTL响应；
肿瘤患者来源的TAMs表达IRF8且具有IRF8依赖的基因程序；
TAM-IRF8基因标签与多种人类恶性肿瘤中的CTL衰竭有关。
结论：
肿瘤中的巨噬细胞来源和功能不尽相同。本文发现肿瘤细胞如何影响单核吞噬抗原递呈细胞，并发现单核细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表达肿瘤细胞抗原，驱动细胞毒性T细胞（CD8+）衰竭，通过转录因子IRF8促进肿瘤生长。



研究思路



研究内容
结果一：乳腺癌中单核吞噬细胞在乳腺中的占比发生变化
作者首先MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型作为研究对象，并分别对DC1s、DC2s、单核细胞（Mono）、乳腺组织巨噬细胞（MTMs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）进行分离计数，发现DC1s和MTMs在肿瘤中的占比降低，TAMs在肿瘤中的占比增加，暗示肿瘤组织中单核细胞向TAMs的分化增强（A）。此外，对各细胞进行转录组测序后发现，Irf8在肿瘤组织TAMs中的表达量显著上升（B-D）。



结果二：IRF8缺陷同时导致肿瘤内DC1s和TAMs减少
根据前述结果，作者锁定DC1s和TAMs细胞以及IRF8基因作为重点研究对象，因此构建了CD11cCreIrf8fl/flPyMT条件性敲除小鼠，该小鼠是在乳腺癌小鼠模型的基础上特异性敲除CD11C+细胞内的Irf8，此种细胞类型同时包含了DC1s和TAMs。流式细胞结果显示，敲除Irf8后，DC1s细胞和TAMs细胞比例均显著下降，且MHCII和Vcam1（TAM终末分化标志）表达也分别下降2.2和1.6倍。



结果三：IRF8在TAMs中驱动广泛的APC基因程序
IRF8是转录激活因子，为了进一步研究IRF8在TAMs中的调控机制，作者分别对CD11cCreIrf8fl/flPyMT条件性敲除小鼠和对照Irf8fl/flPyMT小鼠的TAMs进行了RNA测序。结果显示敲除Irf8后，TAMs中大量细胞表面分子，包括先天免疫受体、抗原处理信号分子表达量都显著降低。



结果四：TAMs依赖IRF8递呈肿瘤抗原并诱导PD-1表达
以往研究发现DC1s细胞具有IRF8依赖的抗原交叉递呈功能，因此作者自然而然想到高表达IRF8的TAMs是否也有相似功能。因此在这里作者引入一个巧妙的小鼠体内抗原递呈系统。简单来说，利用S100a8CrePyMT小鼠（特异性靶向肿瘤细胞）和LSL-USA小鼠（具有包含多个模型抗原序列的通用自抗原表达组件）的杂交，再重组来源于C57BL/6和CD11cCreIrf8fl/fl小鼠的1比1骨髓细胞形成嵌合体。该系统下C57BL/6（对照）和CD11cCreIrf8fl/fl小鼠产生的TAMs能交叉递呈肿瘤细胞特异性抗原，并能与体外SIINFEKL-反应性CD8+ OT-I T细胞共培养比较（A）。
结果显示，CD11cCreIrf8fl/fl 骨髓细胞分化为TAMs的比例更低，TAMs增殖降低，但分化为MTMs的数量增加（B-D）。此外，CD11cCreIrf8fl/fl TAMs表面肿瘤特异性抗原的表达也显著降低，对细胞毒性T细胞PD-1的诱导也显著低于对照组（E-F）。通过RNA测序也发现了TAMs与DC1s的功能区别，即TAMs在T细胞耗竭信号通路富集，而DC1s在效应T细胞激活通路富集（G）。



结果五：巨噬细胞特异性敲除IRF8减弱肿瘤中的CTL细胞耗竭
为了单独研究TAMs的功能（排除DC细胞），作者再次构建了一个单核细胞系特异性敲除Irf8的肿瘤小鼠模型——MafBiCreIrf8fl/flPyMT小鼠。MafBiCreIrf8fl/fl TAMs表面抗原递呈相关分子表达量降低，但共刺激和共抑制因子与DC1s相比无显著差异，且T细胞数量也并未改变（A-D）。
为了探究MafBiCreIrf8fl/fl TAMs是否影响T细胞表型，作者对MafBiCreIrf8fl/flPyMT小鼠和对照组的肿瘤浸润CD8+T细胞进行了单细胞转录组测序。共鉴定到9个类群细胞，C1，C2a，C2b是初始T细胞和早期激活/效应T细胞，在MafBiCreIrf8fl/flPyMT小鼠肿瘤中比例上升，而耗竭T细胞（C3a，C3b）数量减少（E-H）。后续使用流式细胞术和S100a8CreLSL USAPyMT小鼠模型进行验证，也获得一致的结果，且肿瘤体积缩小（I-L）。



结果六：人肾透明细胞癌患者来源的TAMs表达IRF8和IRF8活化基因
做到这里，体内外实验部分差不多了，就需要结合临床进行验证。作者选择了人肾透明细胞癌进行研究，因为这种癌症的一线治疗方法是手术，且在初次药物治疗的癌症患者中可以观察到自然进化的肿瘤诱导免疫反应。流式细胞术分理出4种肿瘤相关MPS细胞，分别是DC1s,DC2s，经典单核细胞和TAMs，而TAMs占有很大比例（A）。与小鼠模型中的结果相同，IRF8在TAMs中显著高表达，表达量高于单核细胞（B-C）。再次对单核细胞和TAMs细胞进行RNA测序，发现小鼠实验中获得的差异表达基因和通路——IRF8激活基因同样显著富集（D）。


结果七：TAM IRF8基因标签能够在人类多种肿瘤中预测CTL耗竭
最后作者再次拓展研究范围，想要将动物模型和患者TAMs中获得的IRF8相关基因标签在更多类型实体肿瘤中进行验证。该基因标签共包含18个IRF8下游基因。首先在肾透明细胞癌数据中进行验证，明确该基因标签的可行性（A-B）。然后从TCGA数据库中选取6种实体瘤RNA测序数据集，包括3种对免疫检查点抗体响应效果较好的肿瘤，以及3种响应不佳的肿瘤。将样本分为IRF8high和IRF8low之后，IRF8high样本能够富集到TAMs和T细胞耗竭标签，表明IRF8依赖的TAM基因程序能普遍促进CD8+T细胞耗竭（C-D）。



总结
这篇文章的亮点其实是在于体内研究肿瘤抗原递呈功能，因此光条件性敲除小鼠就构建了3组，还设计了用以研究肿瘤特异性抗原递呈的小鼠模型系统。尽管IRF8此前在DC1细胞中已知功能，TAMs的促T细胞耗竭也不是才提出的，但通过对肿瘤TAMs的抗原递呈功能研究，解析其通过与DC1s竞争性递呈抗原，从而导致T细胞耗竭的机制，这确实是一个较新，且不落入套路的切入点。
文章末尾作者也提到，这篇文章的机制部分其实仍然比较初步，并未精准研究TAMs中的IRF8通过何种靶基因促进对肿瘤特异性抗原递呈的APC功能，因此未来还需要进一步更深入的研究。
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