《Nature Protocols》：细胞系来源的皮下肿瘤模型在临床前 ...

碧海绅蓝

肿瘤已经成为威胁人们生命安全的最主要的一种疾病，针对性的治疗策略和药物研发如火如荼的开展着。其中，荷瘤动物模型起到至关重要的作用，在临床应用前的药物测试有助于提高其安全性。然而，受限于原位肿瘤模型构建的高难度，现在皮下肿瘤模型占据重要的研究地位。正确的模型构建以及适合的研究方案将有助于提升肿瘤药物的研发进展。
基于此，牛津大学Anderson J. Ryan教授团队概述了不同类型的皮下肿瘤模型，包括它们的一些优点和缺点，以及它们如何适应药物开发过程。相关工作以“The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research”为题于2022年7月20日发表在“Nature Protocols”上。



图1 临床前癌症药物开发。癌症药物开发的步骤显示了癌症模型适合于候选药物的测试， 药物发现和药物开发的步骤经常重叠，而不是按顺序进行

目前小鼠皮下肿瘤模型的构建主要有两种方式：一种是小鼠皮下注射肿瘤细胞，二是将实体肿瘤碎片植入皮肤层(表皮和真皮层)与下层肌肉层之间的空间。当肿瘤细胞来源于小鼠时，将它们被植入到相同基因的小鼠品系中，所构建的模型被称为同基因模型，如果它们被植入到不同的小鼠品系中，则称为异基因模型。当肿瘤细胞来自人类时，该模型被称为异种移植(肿瘤细胞或组织移植于一个不同物种)。当细胞系在体外繁殖，构建产生的皮下肿瘤称为细胞系来源的异种移植(CDXs)，与患者来源的异种移植(PDXs)相反，后者是直接从人类患者身上取出的新鲜肿瘤组织，没有在进行体外培养或扩张。只有同源肿瘤才能在完全免疫的小鼠体内成功生长。



图2 PBAE 536 NPs体外转染具有报告基因的肝癌细胞。(A)聚合物PBAE 536的结构。(B) PBAE 536 NPs透射电镜图。(C)流式细胞术定量Hep3b细胞体外转染效果。(D)不同剂量的GFP DNA转染Hep3b细胞的活力。以DNA质量比为25 (w/w)的聚合物PBAE 536为原料合成了PBAE NPs。(E)转染Hep3b细胞后GFP表达的荧光显微图

目前有超过200种不同类型的癌症，因此建立临床前体内模型来研究每种癌症类型是不现实的。根据癌症统计数据可以提示我们哪些是最常见的类型，因此，需要针对性地围绕某些癌症进行建模。在2016年至2018年期间，英国每年平均有37.5万例新癌症病例，其中超过一半(53%)仅包括四种癌症类型:乳腺癌、前列腺癌、肺癌和肠癌。这种癌症类型的特殊分布并不仅限于英国，同样这四种癌症也是世界上最常见的。为了促进肿瘤模型的开发，目前已经获得数千种反映癌症复杂、异质性等生物学特性的肿瘤细胞系。这些细胞系经常被用来建立这四种常见的癌症动物模型。此外，许多其他细胞系也适用于其他不常见的癌症类型(如肝、胰腺、胃)，系统性研究这些癌症的生长、发展、转移和治疗。





模型构建中除了肿瘤细胞是重要元素之一，小鼠的选择也至关重要，可以直接决定模型构建的成功率。小鼠应该从Charles River, Envigo或者 the Jackson Laboratory等声誉较高的机构采购。此外，需要构建的皮下肿瘤的类型也将决定小鼠的种类。如果需要构建一个同源的肿瘤模型，应该选择相同基因的小鼠品系，如C57BL/ 6和Balb/ c，前者是最广泛使用的实验室啮齿动物，因为它既健壮又容易繁殖。然而，如果需要构建异种肿瘤移植模型，则需要使用免疫缺陷小鼠。其中包括胸腺不全的裸鼠、免疫缺陷型小鼠(SCID)、 NOD /SCID等小鼠。NSG小鼠缺乏成熟的T细胞、B细胞和最自然的杀伤活性；它们在先天免疫和细胞因子信号通路中也有许多缺陷。一般来说,小鼠的免疫缺陷越严重，肿瘤移植率最高。



小鼠皮下瘤模型构建步骤：1. 小鼠适应时间（1- 2周）在细胞注射前的1-2周，确保小鼠有足够的时间从运输过程到新的实验室中恢复过来，然后适应环境。2. 根据注射小鼠的数量不同准备足够的细胞数量（2-3周）在培养中扩大肿瘤细胞的数量，确保注射当天所有小鼠都有足够的细胞。一定要准备好多余的细胞，以便在需要时可以再注射4到6只小鼠。定期检查细胞是否有支原体感染。如发现支原体，应立即处理掉所有细胞，使用新的细胞和试剂。切勿将支原体感染的细胞或物质注入小鼠体内。3. 解冻基质胶（12小时(过夜)）将基质及其将接触到的所有设备或PBS/基质混合物(针头、注射器、移液管头和试管)置于4℃；最好的方法是在注入细胞的前一天晚上将所有东西放入冰箱中。4. 肿瘤细胞注射前小鼠的准备（时间受小鼠数量的影响，每只小鼠允许5分钟）给小鼠脱毛，确保皮下注射区域无毛，以便于细胞注射(无胸腺裸鼠不需要)。在整个实验过程中重复这个步骤，使肿瘤周围的部位保持无毛且容易看到。确保每只老鼠都能被可靠地识别出来，可以用永久性记号笔做清楚的尾巴标记，也可以用剪刀或打孔器在耳朵上留下印记。5. 肿瘤细胞注射前的细胞准备的时间（每个细胞系允许1.5小时）使用胰蛋白酶或其他合适的酶制剂(如Accutase)将指数生长阶段的细胞从组织培养瓶或培养皿中分离出来，并将其保存在100%的细胞培养液中，一直置于冰中以保持其活力6. 使用手动计数法(如玻璃血细胞计计数室)或自动计数法来计数细胞，以确定每毫升细胞数。7. 用无菌技术制备1:1的PBS/基质注射液混合物，冷冻保存至需要时，使其保持液体状态8. 在无菌锥形聚丙烯管(50ml Falcon或等量)中离心(1500g) 5min，取出并丢弃上清，将细胞颗粒重悬在适当体积的注射培养基中，使0.1 ml的体积包含正确的细胞数量，并冷冻保存。如果在同一天准备多个不同的肿瘤细胞系进行注射，每一个细胞系都将保持活力，而下一个细胞系则在准备中，如果它们保存在冰中并定期轻轻地混合。9. 皮下注射肿瘤细胞（时间随小鼠数量的不同而不同；允许2-3分钟皮下注射；如果需要短暂麻醉，4-5分钟）尽快将细胞转移到动物所处地方，确保它们始终保持在冰上以保持活力。10. 轻轻混合细胞悬浮液，以确保单细胞悬浮液:这可以通过使用P1000移液器缓慢地上下移液几次来混匀。对每只小鼠重复此操作，以确保每次注射均匀的细胞悬浮液。11. 使用大口径针头(例如，18号针头)将细胞吸入注射器，因为这将减少注射过程中剪切力造成的细胞损伤。轻轻但坚定地擦拭鼠标以进行侧面注射，使被剪切的区域可见。如果皮下注射进入下背部、肩胛骨之间、后肢或乳腺脂肪垫，应使用短暂麻醉。12. 轻轻地将小鼠皮肤处展开,这样就可以看到注射的区域。皮下注射到下背部,在肩胛骨之间，在后腿或乳腺脂肪垫中，应使用短暂的麻醉。13. 皮下注射，注意确保细胞注射正确：如果针头太浅，肿瘤细胞可能被注射进皮肤(皮内注射)，而如果太深，肿瘤细胞可能被注射进(或穿过)皮肤下的肌肉层。应使用轻度麻醉，直到工人熟练掌握这项技术。14. 确保细胞注射(通常为0.1 ml)平稳、谨慎，不要匆忙，并在几秒钟内完成。15. 注射完成后将针抽出一部分，使基质凝固并使皮肤覆盖针道，然后将针完全取出;在注射肿瘤细胞的部位会形成一个小肿块或肿胀。16. 完全按照非生物发光细胞的描述扩张、制备和注射生物发光肿瘤细胞。17. 一旦细胞被注射，将老鼠放入新鲜的笼子中，这样它们就可以随时获得食物和水;注射后观察小鼠30分钟，确保每只小鼠恢复正常。
文章来源：

深圳市泊静远变压器工厂董先生

呵呵，低调，低调！

曾精点

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