谁说肿瘤研究难创新？这一机制热点结合肿瘤糖酵解方向 ...

金明来

撰写： Emma 来源：小张聊科研平台的“ 课题指南针”公众号，微信公众号搜索“ 课题指南针”即可关注/扫描关注见文末
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前几天为大家介绍了蛋白糖基化修饰这一有潜力的机制热点（看完这篇113分热点综述详解，全面掌握新晋诺奖得主研究领域！），这回和大家介绍一下糖基化相关的机制如何与肿瘤课题相结合。
Warburg效应是肿瘤细胞中常见的现象，包括糖酵解（glycolysis）增强，以及线粒体代谢过程降低，其易于促使肿瘤发生。今天给大家分享一篇文章，其发表于《Nature Communications》（2022年IF=17.694，JCR分区=Q1），文章名为：“O-GlcNAcylation of PGK1 coordinates glycolysis and TCA cycle to promote tumor growth”。此文章着重强调磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）的O-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰（O-GlcNAcylation）如何调控糖酵解和线粒体的三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循环，从而加速肿瘤的恶化。此处，我们关注一下作者是如何展开研究的。
研究摘要（太长不看版）：
1.Warburg效应诱导细胞的葡萄糖消耗率升高，增强糖酵解活动，并抑制线粒体的代谢途径（如TCA循环），从而促进癌症发生。
2.PGK1是糖酵解中首个ATP生成酶，其苏氨酸的T255位点经由O-GlcNAc糖基化修饰。
3.阻塞PGK1的T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰抑制糖酵解、增强TCA循环，及阻碍肿瘤生长。
4.PGK1的O-GlcNAc糖基化修饰协调糖酵解和线粒体的TCA循环介导葡萄糖代谢，从而引发癌症并加重癌症的恶化。



研究思路图





研究内容
1.明确PGK1影响结肠癌的患病率
作者收集50位结肠癌患者的样本（包含肿瘤组织和配对的癌旁组织），检测发现肿瘤组织的PGK1表达量显著高于癌旁组织的PGK1表达量（图a~c）。此外，对比于正常的结肠细胞系（即NCM460和CRYPT），结肠癌细胞系的PGK1表达量显著地提高（图d）。另外，与正常细胞相比，耗尽PGK1的HT-29细胞显著降低裸鼠结肠癌的患病速率（图f）。



2.明确PGK1的T255位点经O-GlcNAc糖基化修饰
蛋白翻译后修饰（PTM）包括磷酸化、乙酰化和糖基化，其参与调控糖酵解酶的结构和功能。1）经化学酶法标记实验，HEK2931细胞溶解产物中O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白质被叠氮-N-乙酰氨基半乳糖（GalNAz）糖标明。标记蛋白质通过Cu（I）介导的[3+2]叠氮化物炔烃环加成（CuACC）化学同生物素共轭，再用链霉亲和素琼脂糖珠捕获。免疫印迹信号的结果显示：在细胞中，PGK1受O-乙酰葡糖胺糖基化修饰（图a）。2）此外，经OGT易位表达或硫胺素-G（TMG）处理后，PGK1糖基化显著增加（图b）。3）不仅如此，H2O2/酰胺（硫醇-氧化化合物）提高活性氧（ROS）的细胞水平，从而促进PGK1糖基化（图c）。4）对比常氧条件，低氧会显著诱导PGK1糖基化（图d）。5）在高糖培养基或高血清浓度下，PGK1糖基化均被提升（图e）。6）研究发现：对比O-GlcNAc糖基化位点（T35，S46，S174，S175，T255，S415）（图f），T255是主要的糖基化位点（图g）。



3.明确T255位点的O-GlcNA糖基化修饰激活PGK1
PGK1催化糖酵解中生成ATP的途径，其以生物合成和氧化还原平衡协调能量生产。体外酶反应显示：过表达O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）或抑制O-GlcNAc水解酶均增强细胞的O-GlcNAc糖基化，从而显著提高PGK1的活性（图a）。其次，H2O2或二酰胺治疗增强PGK1的活性，该过程与糖基化的诱导显著相关（图b）。此外，在OGT过表达时，T255V位点的突变体导致PGK1的活性显著降低（图c）。



4.明确PGK1的O-GlcNAc糖基化修饰对结肠癌细胞的增殖至关重要
与正常结肠细胞系（如NCM460）相比，PGK1糖基化反应在所有结肠癌细胞系中均被观察到（图a）。其中，PGK1的T255位点的糖基化反应在结肠癌细胞中最为重要（图b）。此外，3-磷酸甘油酸盐（3-PG）和ATP（即培养基中PGK1催化反应的初级产物）促进细胞的增殖能力（图c）。另外，T255V位点的突变导致细胞周期停滞于G0/G1期（图d）。



5.明确T255位点的O-GlcNAc糖基化会诱导PGK1的线粒体易位
据报道，PGK1易位至S203位点磷酸化修饰的线粒体。一旦进入线粒体，PGK1作为蛋白激酶磷酸化并激活丙酮酸脱氢酶激酶（PDHK1），随后磷酸化丙酮酸脱氢酶（PDH），从而抑制线粒体丙酮酸代谢，并促进Warburg效应和细胞增殖。在本研究中，细胞经MitoTracker red（线粒体的荧光标记）染色（图a），结果显示：GFP-PGK1 WT与线粒体共定位，且OGT过表达增强共定位的信号。细胞分离和免疫印迹分析也显示：PGK1 WT表达的细胞中，当OGT高表达时，GFP信号在线粒体部分明显升高（图a-c）。此外，OGT过表达导致PGK1的线粒体易位，其显著增加了PDHK1的T338位点磷酸化（图d）。综上所述，T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰促进细胞中PGK1的线粒体易位。



6.明确T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰调控PGK1的线粒体易位
T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰和S203位点的磷酸化修饰均引起PGK1的线粒体易位。据实验结果，S203位点的突变不会影响T255位点O-GlcNAc糖基化修饰的基础水平（图a），而S203位点的磷酸化修饰有可能使PGK1成为OGT催化反应更好的底物。另一方面，在缺氧条件下，OGT过表达几乎不对S203位点的磷酸化修饰产生影响（图b）。因此，T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰和S203位点的磷酸化修饰均为独立的修饰反应。
此外，研究结果显示为：当缺乏S203位点的磷酸化修饰时，糖基化能诱导PGK1的易位；而当T255位点的糖基化修饰不存在时，S203位点的磷酸化修饰会诱导PGK1的易位（图c）。然而，消除S203位点的磷酸化修饰和T255位点的糖基化修饰（S203A/T255V结构体），共定位信号则消失（图c）。综上，S203位点的磷酸化修饰和T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰均独立地介导PGK1的线粒体易位（至图d~f）。另外，根据免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）的实验结果，作者总结认为：O-GlcNAc糖基化修饰可以提升PGK1和线粒体外膜易位酶（TOM20）的相互作用，从而促进PGK1易位至线粒体（图g）。



7.明确PGK1的T255位点的O-GlcNAc糖基化修饰促进肿瘤形成
与体外实验相同，体内实验显示：PGK1的T255位点的糖基化修饰促进肿瘤生长（图a）。不仅如此，OGT的表达量与结肠癌中PGK1的糖基化水平呈正相关（图e），因此，PGK1的O-GlcNAc糖基化修饰与结肠癌的发生密切相关。



研究结论
癌细胞增殖时，葡萄糖代谢相对异常，具体表现为：1）葡萄糖摄取量增多，2）糖酵解的速率提高。然而，癌细胞如何协调糖酵解和TCA循环之间的葡萄糖代谢很大程度上不清楚。在作者的努力下，此文章的结论解决了部分难题。具体而言，作为糖酵解中首个产生ATP的酶，PGK1动态性地受到O-GlyNAc糖基化修饰的调控。其次，T255位点的糖基化反应激活自身的酶活力，并同时诱导PGK1易位至线粒体，随后依赖磷酸化抑制丙酮酸代谢。通过调控上述PGK1的糖基化反应，糖酵解与线粒体代谢相互协调，从而促进细胞增殖和肿瘤疾病发生。鉴于蛋白质翻译后修饰在肿瘤环境中的变化，作者的实验室将继续致力于研究肿瘤中O-GlcNAc糖基化修饰的代谢酶，从而有助于诊断和治疗肿瘤。
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