外源蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达策略（二）

小杜牧羊

提高外源蛋白的转运效率
1. 信号肽改造
外源蛋白在细胞质中翻译成新生肽，新生肽迎过信号肽转运到细胞的不同区域。新生肽的转运根据信号肽的种类分为两种，－种是共翻译转运，另一种是翻译后转运。


信号肽会影响新生肽的转运，不同的转运方式下的新生肽的处理方式不同，进而影响外源蛋白的分泌表达。研究表明，信号肽与外源基因融合后不仅对新生肽转运有影响，而且对ｍＲＮＡ的二级结构、稳定性、翻译效率以及新生肽的折叠加工等均有明显的影响。而上述因素对外源蛋白的分泌表达也具有重要影响，因此，可通过选择合适的信号肽或者对信号肽改造来提高外源蛋白在P.pastoris 的分泌表达。
提高ＥＲ对外源蛋白的折叠加工能力
１．共表达辅助折叠因子
正常情况下，新生肽进入ＥＲ（ＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃＲｅｔｉｃｕｌｕｍ）后，在ＥＲ和高尔基体中被加工成成熟的蛋白质。成熟的外源蛋白根据蛋白类型被分泌到胞外或者停留在胞内。
但是，对于P.pastoris来说，外源蛋白是非生长必须的代谢产物，因此在P.pastoris中表达外源蛋白常常会造成ＥＲ负荷。使得外源蛋白的折叠出现错误，不仅表达的外源蛋白没有活性，而且还会造成反馈抑制，使得外源基因的转录和翻译水平降低。当错误折叠的蛋白大量在ＥＲ中累积的时候（ＥＲ压力），P.pastoris会激活两个主要的应对机制。一个是未折叠蛋白效应，另一个是ＥＲ介导的蛋白降解。ＵＰＲ主要诱导与蛋白折叠相关基因的表达。ＵＰＲ使用三个相近的感应器（Ｓｅｎｓｏｒ）：ＰＥＲＫ／ｅＩＦ２α、ＡＴＦ６和ＩＲＥ１。这三个感应器处于内质网膜上，正常情况下它们和ＢｉＰ结合形成Ｓｅｎｓｏｒ－ＢｉＰ复合体，处
于非激活状态。当ＥＲ中的错误折叠蛋白累积时，ＢｉＰ从Ｓｅｎｓｏｒ－ＢｉＰ中解离出来，和未折叠蛋白结合形成ＢｉＰ－Ｐｒｏｔｅｉｎ复合体，从而将感应器释放出来，使得感应器与感应器结合形成感应器二聚体（Ｓｅｎｓｏｒ－Ｓｅｎｓｏｒ）。这些感应器二聚体具备两个功能：１．激活磷酸化级联反应；２．诱导ＵＰＲ相关基因的表达。ＰＥＲＫ－ＰＥＲＫ激活ｅＩＦ２ａ后，ｅＩＦ２ａ能够降低翻译的起始速率；ＩＲＥ１－ＩＲＥ１激活特异性ＲＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ能够剪接含有内含子的HAC1，激活ＨＡＣｌｐ的表达；ＡＴＦ６－ＡＴＦ６能够促进辅助折叠因子基因的表达。
除了ＵＰＲ外，在ＥＲ内还存在－个和ＵＰＲ具有协同效应的监控系统ＥＲＡＤ。ＥＲＡＤ是和ＵＰＲ平行的一条通路，当ＥＲ中有大量错误折叠的蛋白累积时，ＥＲＡＤ能够将错误折叠的蛋白快速的从ＥＲ中转移出去，并通过细胞质中的泛素蛋白酶系统将错误折叠的蛋白降解。
当ＥＲ中因过表达外源蛋白而造成压力时，细胞为了维持ＥＲ的平衡会启动ＵＰＲ和ＥＲＡＤ，通过ＵＰＲ和ＥＲＡＤ的协同工作，使得ＥＲ重新达到平衡状态。虽然ＵＰＲ效应对于ＥＲ的蛋白折叠能力有一定的促进效果，但是对于细胞来说，外源蛋白过表达是非生长必须的代谢活动，因此细胞在处理这种由外源蛋白过表达造成的ＥＲ压力时，更多的是选择抑制外源基因上游转录翻译以及降解下游错误折叠的蛋白。这与实际的生产目的是不符合的，实际生产中希望ＥＲ具备较高的蛋白折叠能力，同时还需要高的转录翻译和蛋白转运以及极少的蛋白降解。因此可以根据ＵＰＲ和ＥＲＡＤ的效应机制，人为选择性的过表达一些能够提高ＥＲ蛋白折叠能力的基因。其中ＵＰＲ激活的辅助折叠因子就能提高ＥＲ蛋白折叠能力，可以通过过表达辅助折叠因了来补偿蛋白合成引起的ＥＲ蛋白折叠需求。使得外源蛋白在P.pastoris中能够高效地分泌表达。