文献详解丨Nat Commun教你如何深入挖掘肿瘤相关成纤维 ...

风的忧伤

撰写： 生信小师妹 来源：小张聊科研平台的“ i生信”公众号，微信公众号搜索“ i生信”即可关注/扫描关注见文末
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前段时间给大家分享了教科书式巨噬细胞与成纤维细胞的互作机制研究，今天跟大家分享一篇通过泛癌单细胞数据深入探究肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞异质性及可塑性的生信好文。文章标题：Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancerassociated fibroblasts in the tumor microenvironment.


研究背景
成纤维细胞是肿瘤微环境（TME）的主要成分，而癌症相关成纤维细胞(CAF)在癌症发生发展中都起着重要作用。除了直接与恶性上皮细胞相互作用外，CAF还可以诱导正常成纤维细胞激活成CAF，促进内皮细胞的血管生成，招募髓系细胞，以及免疫抑制T细胞。因此，CAF通过与其他TME成分相互作用，在塑造TME中发挥关键作用，显示出它们作为预后因素和治疗靶点的潜在价值。
研究思路
作者对10种实体肿瘤的单细胞数据进行泛癌分析，以期揭示异种CAF的共性及可塑性，并且探究了CAF与TME中其他类型细胞的互作，以及CAF与患者预后及免疫治疗的关系。
研究结果
scRNA-seq分析显示泛癌患者的TME图谱
对10种实体肿瘤类型的226个样本（包括原发肿瘤组织、癌旁组织和正常组织）的单细胞数据去批次效应，聚类分群为34个簇，再根据marker基因鉴定为五种主要的细胞类群，包括成纤维细胞，淋巴细胞，髓系细胞，内皮细胞和浆细胞。值得关注的是，一些簇，特别是C20(FABP4+巨噬细胞)，显示出肿瘤组织特异性。与正常组织相比、早期和晚期原发肿瘤以及肺癌的脑转移组织中的FABP4+巨噬细胞(C20)的比例显著下降，提示FABP4+巨噬细胞可能与肺癌的进展负相关。


鉴定TME中CAF细胞亚群
首先共有8个簇(c1-c8)被注释为成纤维细胞(ACTA2和ACTG2)，并在所有组织类型中出现。根据细胞比例分布的不同，c3和c5中的细胞主要来自正常组织，称为NFS，而其余6个肿瘤丰富的簇是CAF。值得关注的是，胶原活化和基质金属蛋白相关基因在CAF中高表达，提示成纤维细胞在CAF中被激活。此外，与血管生成和免疫调节相关的基因在CAF中显著上调。具体地说，三个数量占主导地位的主要簇(即c1、c2和c4)分别被定义为癌症相关肌成纤维细胞(CAFmyo)、炎性CAF(CAFinfla)和成脂CAF(CAFadi)，其它三个次要成分(即C6-C8)被鉴定为内皮细胞到间充质转化CAF(CAFEndMT)、外周神经样CAF(CAFPN)和抗原提呈CAF(CAFap)。
作者还通过SCENIC分析确定了CAFmyo、CAFinfla和CAFadi中可能存在的调节子，结果发现肿瘤发生相关基因和与肌肉发生相关的调控基因在CAFmyo中富集。此外，与去分化相关基因和与上皮-间充质转化(EMT)相关的调控蛋白分别与CAFinfla和CAFadi相关。


探究CAF亚群的分化轨迹及激活过程
作者将所有癌种的CAF汇集在一起，以探索CAF可能的激活过程。首先通过拟时序分析揭示了从NFS到CAF的两条不同的激活路径，增强了三种不同状态的定义，CAFstate1(NFS占优势)、CAFstate2(CAFmyo占优势)和CAFstate3(CAFadi/CAFinfla占优势)。进一步发现，EMT评分和CREB3L1表达均沿着CAF的激活轨迹逐渐增加。最后，沿着分化轨迹的基因波动显示，CAFstate2倾向于在血管生成中发挥作用，以INS和PDGFRb的过度表达为代表，而CAFstate3同时高表达促血管生成基因和免疫调节相关基因。总体而言，主要的CAF来源于非生物多样性，并演化为不同的分化状态，这些状态可能对TME表现出不同的影响。


探究CAF与TME中其它细胞成分的相互作用
（1）CAF与免疫细胞的互作关系
免疫监视逃逸是癌症的主要标志之一，CAF不仅通过提供物理屏障而且通过影响免疫TME来促进这一过程。通过CellphoneDB分析发现CAF可能通过过表达肿瘤坏死因子配体超家族基因来调节肿瘤浸润性B细胞。例如，CAFstate3通过TNFSF13B_TNFRSF13B/C(B细胞存活/成熟相关基因)与大多数B细胞亚群相互作用。此外，CAFstate3与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）/树突状细胞（DC）等髓系细胞之间的相互作用表明，除了获得性免疫外，CAF还可能调节先天性免疫细胞。总之，CAF，尤其是CAFstate3，可能具有免疫调节作用。


（2）CAF与内皮细胞和上皮细胞的互作
这里作者特别关注肿瘤内皮细胞与CAFstate2/3之间的配受体对，包括NOTCH1/3_JAG1/JAG2、TGFB1_TGFBR3和INS_INSR，它们参与了血管生成相关的VEGF和Notch信号通路。特别是，NOTCH2_JAG2/DLL4、ACKR3_CXCL12和IGF1/2_IGFR1R/2R在CAFstate3和TEC之间存在特异性的相互作用。此外，还估计了三个CAF状态和每个上皮细胞簇之间的通信。有趣的是，CAFstate3也表现出比CAFstate1/2更多的与上皮细胞的相互作用，特别是恶性上皮细胞。然后通过CAF与上皮细胞的配体-受体对富集到一系列癌症相关通路，包括EGFR、Noch、WNT通路。


探究CAF与患者预后及免疫治疗的关系
鉴于CAF和免疫细胞之间的大量互作，特别是CAFstate3(例如，CAFstate3中的PDCD1_FAM3C相互作用)，CAF状态可能在检查点阻断免疫治疗中发挥重要作用。因此，作者基于来自三个独立免疫治疗数据集的患者bulk RNA数据，通过ssGSEA分析来估计3中不同CAF状态细胞的比例，并探究了CAF状态与患者的预后。结果发现CAFstate3的高比例与患者较差的总体生存率显著相关，多变量分析进一步说明了CAFstate3在免疫治疗中具有潜在的独立预后价值。


泛癌分析表征成纤维细胞的可塑性
激活的CAF除了主要来源于正常成纤维细胞（NFS），也可能来源于TME中的有不同生物功能的其它细胞。抗原提呈CAF(CAFap)与肿瘤浸润性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的相互作用明显多于癌症相关肌成纤维细胞（CAFmyo）。此外，CAFap与单核巨噬细胞相关簇(c18-c22)的转录相似性高于与其他成纤维细胞簇(c1-c7)的转录相似性，并表达单核巨噬细胞特异性标志物(如CD68、CD163、CD14)。而且SCENIC分析发现在CAFap中高度富集在TAMs中起极化作用的几个调节子(例如MAFB、SPI1、IKZF1)。这一证据暗示CAFap和TAM之间可能存在关联，因此作者推测CAFap可能是CAFs和TAMs之间的过渡状态。通过拟时间分析发现了一条可能的分化轨迹：TAM-CAFap-CAFmyo，表明CAFap可能处于CAFs和TAMs之间的过渡状态，这可能是CAFs的另一种起源。


除了巨噬细胞和周围神经来源的CAF外，CAF还通过内皮-间充质转化(EndMT)表现出来自内皮细胞的潜在可塑性。有趣的是，内皮细胞到间充质转CAF（CAFEndMT）在成纤维细胞和内皮细胞中显示了marker基因的双重表达，突显了它参与EndMT的可能性。此外，CAFEndMT与CAFmyo和TEC细胞群在转录上表现出极大的相似性。而且CAFEndMT特异性表达与血管生成相关基因及内皮分化和转换相关的调节子。在分化轨迹上，CAFEndMT始终处于从TEC到CAFmyo的过渡阶段。总之，CAFEndMT反映了TECs对CAF的可塑性，并与多种癌症类型中血管生成有关，进而影响肿瘤的转移和进展。


TME中CAF、TEC和TAM之间的三重互作
在所有组织类型中，成纤维细胞、内皮细胞和髓系细胞之间的三重相互作用在TME中占主导地位。其中CAFEndMT与其他TME细胞，特别是TAM的通信最频繁。因此推测TAMs可能在EndMT过程和随后的肿瘤血管生成中发挥作用。此外，在肿瘤样本中发现CAFEndMT与SPP1+TAMs的相互作用多于与SPP1-TAMs的相互作用。特别是，SPP1+TAMs与CAFEndMT之间通过SPP1_a9b1复合体和SPP1_CD44特异性相互作用，CD44的表达沿着EndMT轨迹逐步增加，这一结果表明SPP1_CD44相互作用可能参与了EndMT过程。接下来，作者通过多重免疫荧光验证了这一假设。通过表型图像和密度图分别用于量化标记表达和空间分布。对CAFEndMT细胞的空间密度分布进行了量化，并将其分为高密度区(HDA)和低密度区(LDA)，与LDA相比，SPP1+TAMs在HDA中显著丰富。此外，在7例结直肠肿瘤标本的空间转录谱中，CAFEndMT和SPP1+TAMs标记基因存在显著的相关性，进一步支持SPP1+TAMs和CAFEndMT的关联。上述证据表明，促血管生成的SPP1+TAMs可能通过SPP1_CD44与CAFEndMT之间的相互作用在EndMT过程中促进肿瘤内血管生成，从而提示癌症患者预后不良。


研究结论
总之，该研究系统地描述了不同癌症的CAF，不仅提供了CAF的可能来源，而且突出了CAF在免疫治疗结果和预后中的不同状态。此外，为了加速相关数据挖掘及其在广泛研究中的应用，作者建立了一个交互式网站(https://gist-fgl.github.io/sc-caf-atlas/)。总而言之，尽管需要进一步的实验验证来确定每个CAF簇的功能作用和CAF的不同来源，但该研究通过泛癌对CAF的研究可能会促进未来CAF靶向治疗的开发和应用。
小编有话说
看完这篇文章，小编心中窃喜：又get到一个很好的研究热点！除了巨噬细胞与成纤维细胞的互作研究，巨噬细胞-成纤维细胞转化这个切入点岂不是更香！
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