实战篇|细胞培养之——细胞消化

当代语文

相信很多细胞培养实验的同学对细胞消化做了许多研究，实验室的师兄师姐们也得出了很多有价值的经验，同时也遇到很多人的困惑。在这里结合各位实验专家和自己的经验，介绍一些细胞消化基本操作知识和注意事项，如果不足之处，欢迎补充讨论。
　　我们在细胞培养时大部会以贴壁的形式生长（除了取自血、脾或骨髓的细胞），使用的完全培养基中的血清，含有许多带阳性电荷的促细胞附着因子（层黏连蛋白 Laminine、纤维链接蛋白 Fibronectin 等胞外基质），能帮助细胞附着于带阴性电荷的底物上，并形成键结、贴壁伸展。也就是所谓的～细胞消化Cell Detachment



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常见细胞消化法有三种　
机械消化法、离子螯合法、酶消化法
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机械消化法
　　直接用液体吹打或用刮刀，施予外力让细胞与培养底物分离；适用于贴壁性弱的细胞传代，但相较于其它消化方法，这种外力无法量化控制，细胞分散效果差，且可能会造成大量细胞破损，使内容物释放到培养基，进而影响细胞传代状态。




▲细胞刮勺

离子螯合法
　　细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结，当然也包含各种黏附蛋白（例：整合素、钙黏着蛋白、桥粒等），螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下，抽离这些离子，使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用，让细胞较容易在施予外力时，脱离培养底物并促进细胞分散。
　　0.02% EDTA是细胞传代最常用的离子螯合剂，在37℃作用效果最佳（消化较敏感的细胞可在4℃作用），适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。
　　但EDTA无法用血清终止其反应，所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液（如：PBS）清洗离心，以免影响后续细胞贴盘效果。



▲ EDTA（黑）能螯合二价离子（红）

酶消化法
　　用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质，适用于消化贴壁性稍强的细胞。

上述实验方法中最常见的还是胰酶消化。大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，但是我们发现吸去胰蛋白酶后，残留的那些附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2分钟足够消化细胞（绝大部分1分钟不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是先采用PBS润洗细胞吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化细胞。

什么程度算消化完全呢？
所谓消化并不是细胞全部分散分布形成单个圆形才算消化完好，一般我们肉眼观察贴壁细胞表层，只要能漂浮移动了，多半呈沙粒状漂浮移动，其实已经可以了。说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性。
     细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。
     如果遇到比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以colon cancer为例，比如HCT15, LS411和KM12，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足够了。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。
      针对消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在-20℃，以保持酶活力。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
     我们常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外），受消化影响不是很大。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求极高。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。

PBS洗涤注意事项
消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲，对于一些难消化细胞，那么可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞，不需要配制如此溶液。
结语
其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。
来源：CellMax俱乐部

幽香居士

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