Nature | 肿瘤内菌群 癌症发展和转移的“帮凶”

侠盗布凡

关注“Being科学”微信公众号

了解更多精彩内容和福利！！


在癌症患者的肿瘤中，恶性细胞被一个复杂的非恶性细胞网络所包围，根据其细胞类型和丰度，这些非恶性细胞可能具有促肿瘤或抗肿瘤作用。体外和临床前动物模型表明，肿瘤相关微生物群中的细菌在癌症发展、转移、免疫监测和化疗耐药性中发挥作用。有强有力的分子证据表明，至少33种主要癌症类型的肿瘤内微生物群，以及显示泛细菌标记物与免疫和上皮细胞靶点共定位的成像数据，表明肿瘤内微生物群落可以定位于细胞内部。然而，这些细胞相关生物的确切身份以及它们在患者肿瘤中相互作用的特定宿主细胞类型尚未完全揭示。此外，肿瘤内微生物群的空间分布和特定的宿主-微生物细胞相互作用是否影响肿瘤微环境（TME）内的不同功能，在很大程度上是未知的。
近日，美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心人类生物学部的研究团队在《Nature》杂志上发表了研究型的文章“Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer”（肿瘤内微生物群对癌症空间和细胞异质性的影响）。他们聚焦于胃肠道口腔鳞状细胞癌（OSCC）和结直肠癌（CRC）的极端癌症，并修改了原位空间分析技术和单细胞RNA测序（scRNA-seq），以同时绘制TME内的宿主-细菌空间、细胞和分子相互作用。他们的研究结果揭示了肿瘤中定植的细菌不是随机分布的，这些细菌保护肿瘤免受免疫系统攻击，并帮助肿瘤在体内扩散。





肿瘤内微生物群的异质性

首先，该研究团队对11名CRC患者的44片肿瘤组织进行了16S rRNA基因测序，并观察到肿瘤内微生物群在门和属水平上的组成在单个患者肿瘤中有所不同。β多样性聚类和树状图分析的主成分分析表明，超过三分之一的患者评估（n = 11个中的4个）具有相对稳定的微生物组组成。然而，大多数患者（n = 11名中的7名）表现出不同的水平肿瘤内微生物组的异质性。这表明在一部分患者的肿瘤组织中微生物的异质分布。通过靶向RNAscope–荧光原位杂交（RNAscope FISH）成像，作者直观地确认了这些细菌群落的异质性空间分布，包括有核梭杆菌，在同一肿瘤标本中观察到细菌细胞生物量的密集区和细菌阴性区。
为了进一步了解肿瘤内微生物群的空间分布和身份，该研究团队通过10x Visium空间转录组学对CRC样本和OSCC样本应用了一种无偏见的方法。在组织处理后，每个捕获的微生物转录物（主要由核糖体RNA组成）两侧都有一个来自10倍Visium捕获点的条形码寡核苷酸序列，为肿瘤组织中的细菌转录物提供空间坐标。此外，来自单个微生物转录物的测序读数包含一个独特的分子标识符（UMI），这使他们能够量化这些组织切片中活生物体的细菌转录负荷。使用GATK PathSeq对所得到的测序数据进行评估，以将原位测序读数分类解析到属水平。在每个区块内，靶向RNAscope FISH的连续组织切片证实了这些肿瘤内细菌的空间分布。
总体而言，OSCC和CRC肿瘤中28%和46%的捕获点中分别鉴定出细菌转录物。当检测到细菌转录物时，每个捕获点鉴定出的不同细菌属的数量范围为1至42，OSCC肿瘤中的中位数为8，CRC肿瘤中的中值为2，从1至31。通过将这种空间转录组学方法应用于肿瘤内微生物群，能够直接识别、量化和空间映射患者组织完整的肿瘤组织中的活细菌。在捕获点内检测到孤立属和几个不同属的共定位群落，突出了这些肿瘤组织中肿瘤内微生物群相互作用的复杂性。

微生物定殖的瘤内生态位

鉴于肿瘤内微生物群在单个肿瘤组织内具有异质性分布，该研究团队试图确定这种空间分布是否与TME内的不同功能相关。通过GeoMx数字空间分布（DSP）平台，作者采用靶向方法，量化了77种与抗肿瘤免疫和癌症进展相关的蛋白质的表达谱。实施分段分析以丰富从感兴趣组织区域（AOI）内的免疫或上皮癌细胞室提取的蛋白质数据，通过RNAscope–显色原位杂交（RNAscope CISH）将其标记为细菌阳性或阴性。在两种OSCC的CD45+免疫室中（DSP队列1；n = 8名患者）和CRC（DSP队列2；n = 10名患者）肿瘤，细菌存在于高度免疫抑制的微核细胞中，其特征是成熟CD66b+髓系细胞的富集以及免疫抑制分子ARG1（精氨酸酶1）和免疫检查点蛋白CTLA4（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4）的上调。
此外，在两种癌症类型中，他们检测到磷酸化ERK1和ERK2的水平增加，这表明针对肿瘤内细菌的髓系反应可能通过激活MAPK信号通路发生。在OSCC肿瘤中，与样本中的细菌阴性区域相比，细菌阳性的微小肿瘤中T细胞抑制受体PD-1过度表达。这对应于OSCC和CRC癌组织中T细胞标记物（如CD3、CD8、CD4、CD27和CD44）的相对下调，以及增殖标记物Ki-67的表达减少，并表明T细胞被排除在这两种胃肠道癌的细菌定殖区。

微生物驱动的单细胞异质性

INVADEseq方法随后被用于检查来自7名OSCC患者的新鲜肿瘤组织中的细菌-宿主相互作用。将组织分离成单个细胞后，共聚焦成像显示，OSCC患者肿瘤中的单个细胞含有细胞粘附和细胞内细菌。七种肿瘤的整合scRNA-seq显示，肿瘤内微生物群主要由梭杆菌属（34%）和密螺旋体属（29.8%）的细菌组成。将INVADSeq分析中的细菌读数映射到带注释的单细胞显示，梭杆菌和密螺旋体主要与这些患者肿瘤中的上皮和单核细胞衍生的巨噬细胞-v1（称为巨噬细胞簇）细胞簇相关，总细菌感染率分别为25%和52%。
为了确定优势细胞相关细菌属梭杆菌和密螺旋体是否影响上皮信号通路，梭杆菌或密螺旋体相关单细胞（UMI ≥ 3） 与细菌阴性细胞经过GSEA分析后，作者观察到IFN和JAK-STAT信号显著上调，SERPIN家族分子表达增加；趋化因子如CXCL10、CXCL11、CCL4和CCL3；和金属蛋白酶，包括MMP9和MMP3。独立于特定属的一般细菌阳性上皮细胞和细菌阴性细胞结果表明，与在感染特定分类群的细胞中观察到的影响相比，与癌症进展相关的基因表达和细胞信号通路在细菌阳性上皮细胞中受到轻微影响。这可能反映了分类群特定的上皮细胞相互作用或能力，而不是一般的细菌诱导反应。

细菌诱导的癌细胞迁移

为了评估肿瘤内微生物群的一个主要成员与免疫或上皮癌细胞的直接相互作用，该研究团队使用了体外共培养方法。他们将CRC上皮球体与有核F型CRC分离物共培养，然后将其包埋在胶原基质中，胶原基质中含有均匀分布在整个凝胶中的中性粒细胞。通过使用活细胞共聚焦显微镜，可以追踪到包埋的嗜中性粒细胞在F形核菌感染的球体内，并可以与未感染的球体进行比较。在无核F的情况下，中性粒细胞以4.329µm的平均速度在球体内自由迁移最小值−1. ±0.08766（s.e.m.），平均细胞位移为57.21µm。在有核细胞中，中性粒细胞对细菌感染的反应是降低其迁移能力，平均速度为3.593µm，最小值−1. ±0.08561（s.e.m.），平均细胞位移为34.53 μm。因为它们在球体内部形成细胞团，最大尺寸约为6 h时形成，随后集群逐渐开始解体。嗜中性粒细胞在感染有核梭状芽孢杆菌的癌细胞球体中的聚集和滞留表明，肿瘤内微生物群在患者肿瘤的细菌化微粒中中性粒细胞的富集中起着积极作用，正如通过空间分布观察到的那样。




作者还发现，感染有核F的CRC上皮细胞脱离球状体，并作为单个上皮细胞迁移到周围的胶原凝胶中。值得注意的是，当迁移的癌细胞侵入胶原凝胶时，细胞内细菌被检测到。侵袭性细菌不仅促进胶原基质中癌细胞的侵袭，还改变了受感染的癌细胞的运动模式，从而在功能水平上促进了细胞的异质性，如在细胞迁移通过凝胶时测量的大范围细胞位移和速度值所示。为了识别所涉及的改变的信号通路，使用nCounter平台分离含核梭形芽孢杆菌的球体进行转录组分析。通路水平的差异表达表明，暴露于有核F导致参与癌症进展的信号通路的显著上调，包括细胞外基质的重塑、转移和细胞粘附和迁移，以及通过生长因子如EGFR和PDGF的信号上调，并通过EMT和NF-κB途径发出信号。总之，这些数据表明，来源于人类CRC的有核F在细菌感染部位积极诱导髓系细胞的募集，并促进CRC上皮细胞的转录变化，从而促进对周围环境的入侵，并可能赋予静止特性。
总而言之，基于基因组学的研究表明，大多数主要类型的人类癌症都含有肿瘤内微生物群。这些微生物群落因癌症类型而异，而特定的细菌可以促进癌症的发生和发展，影响患者对治疗的反应，从而影响生存。然而，存在的内在异质性使得人们很难理解TME的组成部分，包括天然组织环境中细菌与宿主的相互作用。空间转录组学和scRNA-seq技术的发展使得TME的真核细胞成分得以研究，但迄今为止，TME中肿瘤内微生物群的影响一直被忽视。
在这项研究中，通过调整和应用这些技术，他们得出结论，肿瘤内微生物群在人类肿瘤中是非均匀分布的，它是TME的一个基本组成部分，可以改变不同细胞室的生物学，影响抗肿瘤免疫和癌上皮细胞的迁移。通过激活JUN和FOS家族的转录因子，细胞内细菌可以生成与癌细胞侵袭、转移、DNA损伤修复和细胞休眠一致的基因。同样，侵袭性细菌负责招募髓系细胞，通过JAK–STAT信号途径诱导炎症反应，通过向周围环境分泌特定的白细胞介素和趋化因子，促进T细胞排斥和肿瘤生长。尽管作者在此重点关注胃肠道极端的两种癌症类型，但他们所描述的工具和技术可用于分析迄今为止已显示含有肿瘤内微生物群的33种主要癌症类型。分析微生物群与人类癌症的相关性，评估肿瘤内微生物群的功能效应，从而确定预防和治疗此类癌症的分子和细胞靶点。