内分泌学一区，空间代谢组学解析肾脏修复细胞中特异性代谢 ...

阿布小贾

空间代谢组学研究方法正成为一种越来越重要的手段，以提供深入了解原位组织细胞的异质性，以及细胞如何在其微环境中相互作用和行为做出一定的解释。由于巨大的结构多样性、快速的周转率和在有限的样本量中的低分析物丰度，在单细胞分辨率下分析整个细胞代谢物具有挑战性。因此，高空间分辨率代谢组学方法被提出作为一种在单细胞分辨率下测量代谢物和脂质的空间分布的方法。同位素示踪和空间代谢组分析相结合来作为原位评估代谢动力学的方法。

2022年9月，莱顿大学医学中心课题组在《Nature Metabolism》期刊（IF:19.865）发表了题为“Analyzing cell-type-specific dynamics of metabolism in kidney repair”的研究成果，研究提出了一种先进的空间分辨率代谢组学方法，利用基质辅助激光解吸/电离质谱成像结合同位素示踪的空间代谢组学方法。这种方法允许在一个复杂的异质性组织结构的背景下，绘制中心碳代谢的细胞类型特异性的动态变化（如肾脏），结合多路免疫荧光染色，该方法可以检测目标细胞类型的代谢变化和营养分配，这在双侧肾缺血-再灌注损伤（bIRI）实验模型中得到了证实。





研究思路





研究结论

1.细胞类型特异性动态代谢测量和分析
通过使用13种C标记的营养物质，可以追踪13种C同位素与糖酵解和三羧酸（TCA）循环的主要中间体的时空结合（图1a）。使用不同的标记营养物质不仅可以可视化随时间的动态变化，还可以解决它们对特定代谢途径的贡献。为了实现这一点，作者使用了一个组织培养系统，其中350µm厚的新鲜小鼠肾脏振动组切片（图1b）孵育2小时。运用空间代谢组学实验，将切片染色，随后使用多路免疫荧光（IF）显微镜成像，以进行细胞类型鉴定（图1c）。为了在1像素内没有批效应的情况下显示所有动态代谢变化，作者遵循了Stuart等人在Seurat包14中介绍的两步过程：(1)使用单像素脂质谱识别两个数据集之间的锚点；(2)通过k-最近邻（KNN）分析从标记数据集中转移所有测量的13个富c代谢产物的丰度，将13个c标记代谢产物产量计算到对照数据集（图1d）。最后，在计算值生成的伪图像中可视化了代谢动力学的原位异质性（图1e）。




图1 | 细胞类型特异性动态代谢测量和分析的工作流程

2.小鼠IRI肾脏的脂质异质性
为了可视化整个肾组织切片的整体代谢异质性，作者使用了20×20µm像素分辨率的空间代谢组学方法，根据其特定的脂质特征，在空间和分子上分辨了所有主要的肾脏结构（图2a和扩展数据图1）。肾bIRI两周后，作者发现了额外的具有独特的簇（Injured_1、Injured_2、Injured_3和Injured_4）的脂质特征，与LTL和e-钙粘蛋白染色丢失相对应（图2a-c）。然后，作者使用集成的3D UMAP分析生成空间分割图像，显示肾脏分子组织学。这些图像显示，在bIRI肾的皮质和外髓质中均存在持续的肾小管损伤（图2d）。与肾皮质（PT-S1/PT-S2）相比，外髓质外条纹（PT-S3）的PT结构明显丢失（图2e)。这些观察结果也通过组织病理学染色得到了证实（图2f）。




图2 | 小鼠IRI肾脏的脂质异质性

3.假肾PT细胞的动态代谢测量

为了探讨肾皮质PT和外髓质外条纹的代谢异质性及其对损伤的反应，在空间代谢组学后，进行IF染色以确定细胞类型（图3a）。作者可以区分两个PT-S1和PT-S2皮质段和一个髓质PT-S3段(图3a-c）。作者将PT-S1和PT-S2结合起来进行后续分析，因为作者不能根据LTL染色或它们的位置对它们进行注释。同位素分析表明，与PT-S1/PT-S2相比，PT-S3具有较低的己糖M+6（[U-13C6]己糖）和较高的乳酸M+3（[13C3]乳酸）富集度（图3d）。此外，作者发现R5P/X5PM+3（糖酵解分支）的富集程度较低，而在PT-S3中进入三糖酸循环的谷氨酸的富集程度较低（图3d）。

PT-S3中谷氨酰胺含量较低，与PT-S1/PT-S2细胞相比，谷氨酸富集量较高（图3e）。值得注意的是，来自同一样品的PT-S3中[13C4]苹果酸和[13C3]谷氨酸[13谷氨酸的富集相对低于PT-S1/PT-S2，表明[U-13C5]谷氨酰胺和[13C5]谷氨酸对PT-S3氧化TCA循环的贡献较低（图3e）。在PT-S3中，亚油酸[U-13C18]通过脂肪酸氧化对[13C2]谷氨酸同位素的贡献也较低（图3f)。结合这些数据，作者发现[U-13C5]谷氨酰胺，而不是[U-13C6]葡萄糖或[U-13C18]亚油酸盐，是谷氨酸在所有PT区谷氨酸的主要碳源（图3g）。




图3 | 假肾PT细胞的动态代谢测量

4.bIRI肾PT细胞的动态代谢测量
作者试图通过比较健康的PT（LTL+VCAM1-）和适应不良修复失败的PT（VCAM1+；FR_PT），来确定bIRI后的代谢（不良）适应（图4a）。在空间代谢组学研究之后，作者选择了所有的PT像素，根据LTL、VCAM1和KIM1 IF染色来确定（图4b）。根据脂质谱分析，随后可以鉴定出四种PT类型：LTL+VCAM1-KIM1-（PT-S1/S2）和LTL+VCAM1+（FR_PT1），外髓质外条纹的LTL-VCAM1+（FR_PT2和FR_PT3）和LTL+（PT-S3）（图4c，d）。根据皮质谱，皮质区域的簇显示了不适应修复的轨迹（图4e）。

然后，作者计算了伪时间分数与几种同位素的13C富集的相关性（图4f）。从健康PT区域向逐渐受损的PT区域的轨迹之后，伪时间评分与[U-13C6]己糖富集（平均r=-0.56，P<0.001）及其下游产物谷氨酸（平均r=-0.38，P<0.001）呈负相关，但与[13C3]乳酸富集（平均r=0.22，P<0.001），以及FR_PT中更多的总乳酸存在（图4j）。一种可能的解释是，在FRPT中，糖酵解通量较高，而[U-13c6]葡萄糖对TCA循环的贡献较低（图4f，g，i），尽管不能排除其他来源对总乳酸有贡献。在氧化TCA循环中，还观察到[U-13C5]谷氨酰胺富集和标记谷氨酰胺衍生的同位素也有所减少（图4f，h，j），但与葡萄糖和亚油酸相比，谷氨酰胺仍然是FR_PT中谷氨酸的主要碳源（图4k）。




图4 | bIRI肾PT细胞的动态代谢测量

研究结论

• 开发了一个平台来检测单细胞分辨率下细胞类型特有的动态代谢变化。
  
• 证明该平台可应用于组织样本，可以识别单个细胞类型内的微环境的代谢异质性。
  
• 设计的方法可以用于研究一般的组织稳态，检测细胞特异性代谢的变化。
  此前，单细胞代谢组学研究集中于分析单时间点代谢“快照”，但关键是缺乏对细胞代谢动态成分的洞察。本文采用高空间分辨率空间代谢组学平台，使用同位素追踪，允许原位细胞类型特异性的动态代谢测量，以揭示细胞所在组织结构中的细胞脂质代谢的变化。因此，为后续研究提供真正全面理解生化改变和细胞类型特异性功能、代谢通量和动态解释之间相互作用的方法。
  

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